Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques dans la Leucémie

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Niveau: Secondaire, Lycée
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences et Vie de la Terre MEMOIRE Présenté par Stéphane JOLY Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique Des Hautes Etudes Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques dans la Leucémie Aigüe Myéloïde Soutenu le : 2 février 2010 Devant le jury : Xavier RONOT Président Claire RACAUD-SULTAN Rapporteur Jean Marie EXBRAYAT Examinateur Xavier THOMAS Examinateur Véronique MAGUER-SATTA Examinateur Laboratoire EPHE : Reproduction et Développement des Vertébrés Directeur : Jean-Marie EXBRAYAT () 15 rue du Plat – 69 288 Lyon Cedex 02 Laboratoire d'accueil : INSERM U590 Oncogenèse et Progression Tumorale Directeur : Alain PUISIEUX Responsable scientifique : Véronique MAGUER-SATTA () Centre Léon Bérard – 28 rue Laënnec – 69 373 Lyon Cedex 08 RESUME La niche hématopoïétique qui renferme les cellules souches influence la leucémogénèse et la EPHE Banque de Monographies SVT 1

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  • traitements sur l'expression de isoformes de tp73

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Publié le 01 février 2010
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Langue Français

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  
 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences et Vie de la Terre  MEMOIRE  Présenté par  Stéphane JOLY   Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique Des Hautes Etudes   Isolement et caractérisation des cellules souches leucémiques dans la Leucémie Aigüe Myéloïde    
Soutenu le : 2 février 2010  Devant le jury :                       Xavier RONOT Président Claire RACAUD-SULTAN Rapporteur Jean Marie EXBRAYAT Examinateur Xavier THOMAS Examinateur Véronique MAGUER-SATTA Examinateur    Laboratoire EPHE: Reproduction et Développement des Vertébrés Directeur : Jean-Marie EXBRAYAT (bxaray@tnuvic-tajmerf.noyloh) 15 rue du Plat – 69 288 Lyon Cedex 02  Laboratoire d’accueil: INSERM U590 Oncogenèse et Progression Tumorale Directeur : Alain PUISIEUX Responsable scientifique : Véronique MAGUER-SATTA (MAGUER@lyon.fnclcc.fr) Centre Léon Bérard – 28 rue Laënnec – 69 373 Lyon Cedex 08 RESUME  La niche hémato renferme les cellules souches influence la leucémo et la
résistance des cellules souches leucémiques (CSL) aux drogues utilisées en chimiothérapie. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents composants de la niche et proposer de nouvelles stratégies de traitements des leucémies, il est nécessaire d’isoler chacun des différents partenaires (cellules souches mésenchymateuse, cellules souches leucémiques…).             L’objectif de notre étude est d’isoler et de caractériser les cellules souches leucémiques (CSL) dans la Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM) et d’étudier le rôle du microenvironnement dans la résistance de ces CSL aux traitements de chimiothérapie. Pour cela des prélèvements de donneurs sains et de patients atteints de LAM ont été utilisés. Des tris cellulaires ont été réalisés avec des marqueurs décrits dans la littérature comme spécifiques des cellules souches leucémiques de LAM (CD90, CD33 et CD123). Les populations triées ont ensuite été réensemencées pour des tests fonctionnels pour déterminer le compartiment des progéniteurs leucémiques et celui des CSL. Le phénotype des progéniteurs leucémiques n’a pas pu être déterminé, par contre les CSL ont été retrouvées pour une partie des patients testés dans la fraction de phénotype CD34+CD38- CD123+ tandis que les cellules souches hématopoïétiques saines sont de phénotype CD34+CD38-CD123-.   L’étude moléculaire nous a permis de confirmer la dérégulation deBmi-1dans la LAM mais également d’autres gènes comme par exempleTP73 dont les isoformes sont surexprimées dans la LAM et notamment dans les LAM M1 et M5.  A partir des premiers résultats obtenus sur les cellules primaires, nous avons pu déterminer parmi les lignées de LAM à notre disposition deux modèles, les KG1 modèle de progéniteurs leucémiques et les KG-1a modèle de CSL. Ces modèles nous ont permis d’étudier la réponse aux drogues de chimiothérapie (daunorubicine et resvératrol) en condition d’adhésion ou non. Nous nous sommes ensuite intéressé à l’expression des isoformes deTP73et d’autres gènes en réponse aux traitements. Les premiers résultats obtenus mettent en évidence une modification de l’expression des isoformes du gèneTP73 en réponse aux traitements. Nous avons également put observer que l’effet des traitements sur l’expression de isoformes deTP73 peut être modulés par l’adhésion à la fibronectine.  Mots clefs : Cellule souche leucémique, microenvironnement, TP73      Partie I : Introduction bibliographique  Introduction générale            I.               Les cellules souches…………………………………………………………………p.1  
SOMMAIRE
a.     Généralités b.     Les différents types de cellules souches………………………………………...p.2
c.     Auto-renouvellement et division asymétrique…………………………………..p.3 d.     La potentialité des cellules souches e.     Caractéristiques des cellules souches…………………………………………... p.4  e.1. Identification des cellules souches  e.2. Caractéristiques moléculaires et biochimiques……………………………..p.6  
     
  
II.              modèle hématopoïétique……………………………………………………....p.11 Le  a.     Définition et fonction de l’hématopoïèse b.     Origine embryonnaire………………………………………………………….. p.12 c.     Les différents compartiments de l’hématopoïèse………………………………  III.           La niche hématopoïétique…………………………………………………………..  a.     Localisation et structure physique de la niche hématopoïétique b.     Les deux types de niche hématopoïétique……………………………………... c.     Mécanismes d’action de la niche hématopoïétique…………………………….
IV.          Cellule souche et cancer……………………………………………………………  a.     Définition de la cellule souche cancéreuse b.     Mise en évidence des cellules souches cancéreuses……………………………
V.            La Leucémie Aigüe Myéloïde……………………………………………………...
 p.13
 p.15
 p.17  p.19
 p.23
 p.25
 p.28
a.     Définition b.     Les différents types de LAM et leur classification…………………………….. p.29 c.     Les antimitotiques dans le traitement des LAM : principale thérapeutique…… p.30 d.     Approche thérapeutique………………………………………………………... p.31 e.      p.33Le cas particulier de la LAM promyélocytique : LAM de type 3……………... f.       p.34Les nouvelles molécules en cours d’étude……………………………………...
VI.           p.37Les éléments de dérégulation des cellules souches leucémiques dans la LAM……
a.     Phénotype et identification des CSL de LAM a.1. Indentification par les marqueurs membranaires a.2. Les autres moyens de caractériser les CSL………………………………………... p.39 b.     Mécanismes de résistance des CSL……………………………………………. p.40
ABREVIATIONS
 p.41  p.43
 p.45
c.     Rôle de la niche dans la résistance……………………………………………... d.     Dérégulation de la famille p53………………………………………………….  VII.        Objectif de travail…………………………………………………………………..                 Unité :  °C = Degré Celcius % = Pourcentage µg = Microgramme nm = nanomètre                                                                          µL = Microlitre ml = Millilitre h = heure min = Minute µM = Micromole / Litre mM = milimolaire mg = Milligramme s = seconde  Abréviations :  ABC = ATP Binding Cassette ADN = Acide DésoxyriboNucléique ADNc = Acide Desoxyribo Nucléique complémentaire ALDH = Aldéhyde Déshydrogénase ARN = Acide RiboNucléique ATP = Adénosine Tri Phosphate BMP = Bone Morphogenetic Protein BSA=Albumine Sérique Bovine
CD = Cluster Differentiation CFC = Colony Forming Cell CS = Cellules Souche  CSC = Cellule Souche Cancéreuse CSH = Cellule Souche Hématopoïétique CSL = Cellule Souche Leucémique CSM = Cellule Souche Mesenchymales DMSO = Diméthyle Sulfoxyde DNTP = désoxyNucléotides TriPhosphate  EDTA = acide EthylèneDiamineTétraAcétique FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter FAK = Focale Adhesion Kinase FITC = Fluorescein Iso ThioCyanate Fn = Fibronectine G-CSF = Granulocyte Colony Stimulating Factor GM-CSF = Granulocyte Macrophage – Cell Stimulating Factor GSK3b = glycogène synthase kinase 3 beta Ig Immunoglobuline = IMDM = Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium KO = Knock Out LAM = Leucémie Aiguë Myéloïde LMC = Leucémie Myéloïde Chronique LTC-IC = Long Term Cultur Initiating cell MAPC = Multipotent Adult Progenitor Cells MEC = Matrice ExtraCellulaire MNC = Mono Nuclear Cells NOD / SCID = NonObese Diabetic / Severe Combined ImmunoDeffiscient PBS = Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PCR = Polymerase Chain Reaction PCRQ = PCR quantitative RT = Reverse Transcriptase RPMI = Roswell Park Memorial Institute RT-PCR = Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SCID = Severe Combined ImmunoDeffiscient VEGF= Vascular Endothelial Growth Factor