CALPAÏNES 1 ET 3: INTERACTIONS AVEC LA STRUCTURE CONTRACTILE

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE Présenté par COULIS GERALD Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes CALPAÏNES 1 ET 3: INTERACTIONS AVEC LA STRUCTURE CONTRACTILE Soutenu le 24 novembre 2003 devant le jury suivant: Président: Dr Exbrayat J.M. Rapporteur: Dr Benyamin Y. Rapporteur: Dr Coudert J. Examinateur: Dr Ouali A. Laboratoire de Motilité cellulaire EPHE Directeur: Dr Yves Benyamin Université Montpellier 2 Laboratoire de biochimie, Directeur: Dr Ahmed Ouali Station de recherches sur la viande, email: INRA, Centre de Clermont Ferrand-Theix Coulis Gérald TEL: 04-73-62-44-56 e-mail: ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE CALPAÏNES 1 ET 3: INTERACTIONS AVEC LA STRUCTURE CONTRACTILE COULIS Gérald RESUME La variabilité de la qualité de la viande, spécialement de la tendreté, demeure le facteur limitant principal de son acceptabilité par le consommateur. Il est admis que les enzymes endogènes jouent un rôle principal dans la dégradation de la structure contractile qui est directement liée au développement de la tendreté. Parmi elles, les calpaïnes, des protéases calcium dépendantes qui ont une activité protéolytique importante vis à vis de nombreux substrats, sont largement étudiées.

  • protéines sarcoplasmiques

  • acide ethylène

  • structure du muscle

  • messager atp

  • site de fixation de la calpaïne

  • titine

  • p94

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Publié le 01 novembre 2003
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre  MEMOIRE  Présenté par COULIS GERALD Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes  CALPAÏNES 1 ET 3: INTERACTIONS AVEC LA STRUCTURE CONTRACTILE  Soutenu le 24 novembre 2003 devant le jury suivant: Président: Dr Exbrayat J.M. Rapporteur: Dr Benyamin Y. Rapporteur: Dr Coudert J. Examinateur: Dr Ouali A.   Laboratoire de Motilité cellulaire EPHE Directeur: Dr Yves Benyamin Université Montpellier 2  Laboratoire de biochimie, Directeur: Dr Ahmed Ouali Station de recherches sur la viande, email:frau.orni.tnomrelc@ila INRA, Centre de Clermont Ferrand-Theix  Coulis Gérald TEL: 04-73-62-44-56 e-mail:nra.frermont.iuoil@slccg ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE  CALPAÏNES 1 ET 3: INTERACTIONS AVEC LA STRUCTURE CONTRACTILE  COULIS Gérald  RESUME principal de e pr e a es  rlsdcvméuaauslbn eupissc lsta dtalrïa'laanup  tsenadsd s ï,eét  ntseeg eptosrn sr tanls, éo teddot dduaaleoLnLietrar  mdaia sreqai o  ug nuvcqmpnecechaartt e iiremndonidbottpeta'iiét netfbnlaaei iexitfsdbcnliu p'iieéa sratllsttciti aéin utrseqt otcéuie didu aolnqicceple oétnu craElue ii r arsducL c .eleeIq ome tScu ctn ecoadeAc lonsé.emivt  nrtpreaéCnésearnt oeiecnhdz attdlmtoeiybaela dim lmenlea imtaet  qetsébévues  tiai ebuhas aqtiroen és.uosdtedd iltaIe e e oltsso , dig u eeinnsfirrsnteaq pte l.  cu'lécu'atactenéefdie.te fuaaimm lrCtnaeise eeisc nt  mn tp'fcétiaqree u v ulotdrnipit tettaélaéa é eneiisld   sqn epepa dssru lr u looeeeepa t ns ndoémb tn(izéoiueiényvletnn t yredsdmh dtl eriiaeeopqb ex sprtio ueptéépe ruee,sedr n ouuirdedmdrlame tsouiea)mitmpgtn  rsètocopee  rnon euadtd rrenaseteestms nr r sletajleô aezveotla  t  tuaanrsfveienteaailnits  tnc cid àdttls ào 'reefsau reuuavatpnmriréi vss ssr. él oa  islôaiPdinlpmrcotea étsirr pitc enavmuiprofinr iiotiitcn méfqueeicsurlbesi lerperee ssasl utl,ee xsunn uant c oyen e n une at lfeaonvnvecc-t ciloaagl netpsirta  ilïpnanh eey.p  srdiALaopenlrsose è gxclsieae ql  auapcm etaéiuïsto nsiéecnn is l d edvo eiae vtnno lo plac oiléma'ld noitarTo. psrs oiefutiane.ser srutrapseriler ar Ctéaciaer sed saptrneaïne 3 m la calped issua sianotscnd aseco le ituéé étrglaenemétt éidum se sia sedquestions resten tnes suepsnp raèrlicutilet enemsruiasn  eel iuq49p al tianerpmoui cxe qmplen coévu sbresno a ovbln . otwen erstp-ite 49ditpna el'antipefié par itp-oc tseeéifiruua qleabe ll end a9p.lL  tts 4see moxe davain tr sedrbif ,sesuongea ollse inr suuéee êm mLaatrvseobté a noitceffe é a µ puisque ce compl après purification d'ucnt reoxmtréatirti ed ed ep rmotaésisnee sé tsaanrtc iopflrauscmiques. La dissociation de ce complexe en SDS, nous lad opn9n4e.  uSnon ensemble de polypeptides qui suscitent l'intérêt en patrutiecuuslei,e ri l usne rpaoitl ynpéecpetsisdaei rdee d em asse proche de celle de e. Comme lidqadou epemn 9tli4aif, i flciaaxs t aiµtZoi-8noc  naeeltnp I as5ïp ndeee  slea  ftiixtiens iset,u ern  dloaeu  stfi itaxivnatoei.no snA  t depena trlétain  rd c'daaleffp iranéïsenrue l lt1ea  tsesin tpterr eéd cleeé fsdi exdnaottsim ocania nrdaeesc  tlIéa2r i cseapatl rnpIot5a clï éend deese  ilstra euà  rt  dislteaio  nfnteii t,xsi aéantqueiu. o nenEi nvneç enaamtgruoe  ndlteer salnat a ne lium, nous l odce allais coanlsp laeï ne sur notre fragment incluant les domaines Z9 et I1 de la titine était indépendante du ca c
rès fortement du calcium er ant la lpioglnyem Nér1i.s aNtioouns  daevso nmso lméocunltreés  qdeu et itcienttee.  rLéeg riôolne  éptahiyt scioalpoagbilqeu de eq fuiix eern  tdécoule est d'assurer une pmeilmleetutre stabilité du sarcomère.  Mots clés:calpaïnes, p94, titine, calcium, muscle, calpastatine, chromatographie d'affinité, ELISA, immunoprécipitation, fluorescence.  SOMMAIRE  Abréviations                                                                                                                                   1 Introduction                                                                                                                                   2 Etude bibliographique: Les systèmes protéolytiques du muscle                       4  I Les serines protéases                                                                                                                                                 4 1Les serines protéinases musculaires 4  II Le système des Protéasomes 4 1           Le protéasome 20S                                                                                                                                                   4 1.1  Structure4 1.2  Mécanisme d'action5 1.3  Activités enzymatiques5 1.4  Régulation                                                                                                                      6 1.4.1         Activateurs 6 1.4.1.1               Physiques 6 1.4.1.2               Le PA28 6 1.4.1.3               Le 19S 6 2           Le protéasome 26S6 3           Fonctions biologiques des protéasomes 20S et 26S 7 3.1  Protéolyse dépendante de l'ubiquitine et de l'ATP 7                     3.2  Rôle dans le système immunitaire 7 3.3  Dégradation des protéines oxydées ou anormales 7 3.4  Formation de complexes8  III Les enzymes lysosomales 1           Mécanismes d'action                                                                                                                                               8 2           Régulation de l'activité des cathepsines 9 2.1 pH                                                                                                                                                                                   9 2.2 Inhibiteurs  9 2.3  Fonctions physiologiques 9  IV Un système protéolytique singulier: les calpaïnes                                              11  1Les calpaïnes conventionnelles 11 1.1Structure                                                                                                                                                             
8                                                                                                                                  
 11 1.1.1La petite sous unité                                                                                                                                                 11 1.1.2La grande sous unité                                                                                                                                              12  1.2Localisation                                                                                                                                                      13  1.3Régulation                                                                                                                                                         14 1.3.1Leur inhibiteur spécifique: la calpastatine                                             14 1.3.1.1 Structure 14 1.3.1.2 Localisation 14 1.3.1.3 Diversité moléculaire 15 1.3.1.4 Le domaine L 15 1.3.1.5 Domaines d'inhib on 16 iti 1.3.1.6 Mécanisme d'inhibition 16 1.3.1.7 Fixation de la calpastatine aux domaines de fixation du calcium 16 1.3.1.8 Conclusion 17 1.3.2 Activation des calpaïnes 17 1.3.2.1 Le calcium 17 1.3.2.2 Les activateurs18                                                                 1.3.2.2.1 18Les activateurs protéiques 1.3.2.2.2Les phospholipides 18 1.3.2.2.3 18Les régions A et C de la calpastatine 1.3.2.3 Mécanismes d'activation 19 1.3.2.3.1L'autolyse: hypothèse de la proen yme 19 z 1.3.2.3.2Hypothèse de l'activation par les membranes 19 1.3.2.3.3 20Les procalpaïnes: des protéinases actives 1.3.2.3.4 unités entreAutre mécanisme possible: activation impliquant la dissociation des sous elles 21 1.3.2.3.5Conclusion 21                                                                                                 1.4Fonction des calpaïnes                                                                                                                                          22 1.4.1 Indicateurs de l'activité protéolytique 22 1.4.2 Rôle des calpaïnes 22 1.4.2.1 Renouvellement myofibrillaire 22 1.4.2.2 Fusion des myoblastes 23 1.4.2.3 Croissance musculaire 23 1.4.2.4 Prolifération cellulaire 23 1.4.2.5 Apoptose                                                                                                                                                  24 1.5Pathologies associées24  2.La superfamille des calpaïnes25 2.1Description générale26 2.1.1 Les homologues de calpaïne chez les invertébrés 26 2.1.1.1Drosophila melanogaster 26 2.1.1.2Caenorhabtidis elegans 26 2.1.2 Les calpaïnes tissu spécifiques chez les mammifères 27 2.1.2.1 La Lp82, spécifique de l'œil 272.1.2.2 Les nCL-2 et nCL-2', spécifiques de l'estomac27        2.1.2.3 La nCL-4, spécifique du tube digestif 272.1.2.4 La             CAPN6, spécifique du placenta                                                                        27 2.1.3 La calpaïne 10, une protéine atypique ubiquitaire 28 2.1.4 La p94, la calpaïne spécifique du muscle 28 2.1.4.1 Structure 29 2.1.4.2 Expression 29                                                                             2.1.4.3 Localisation 29
2.1.4.4 Propriétés de la p94                                                                                                          29 2.1.4.5 Interaction avec la titine 30 2.1.4.6 Rôle physiologique dans le muscle 30 2.1.4.7 Implication dans la LGMD2A 30 Le muscle strié                                                                                                                                                      32   I La structure du musc e                                                                                                         32 l 1           Les myofibrilles32 2           Le réticulum sarcoplasmique32  II Les protéines musculaires                                                                                                  33 1           Les protéines du tissu conjonctif 33 2           Les protéines sarcoplasmiques 33 3           Les protéines myofibrillaires 33 3.1  Les protéines contractiles33 3.1.1      La myosine 33 3.1.2      L actine 34 ' 3.2  Les protéines régulatrices 34 3.2.1      Au niveau du filament fin 34 3.2.2      Au niveau du filament épais 34 3.3  Les protéines du cytosquelette 34 3.3.1      La strie Z 34 3.3.2      Les filaments intermédiaires transversaux 35 3.3.3      Les filaments longitudinaux 35  III La titine, une protéine indispensable à la viabilité du sarcomère35 1           Généralités                                                                                                                                                               35 2           Structure                                                                                                                                                                    35 2.1  Eléments constitutifs35 2.2  Organisation au niveau de la ligne M36 2.3  Organisation au niveau de la bande A36 2.4  Organisation au niveau de la bande I 36 2.5  Organisation au niveau de la strie Z36 3           Interactions avec la structure contractile 37 4           Fonctions physiologiques 38 4.1  La titine: l'architecte moléculaire de la myofibrille 38 4.2  La composante élastique du sarcomère39 4.3  La titine: l'architecte moléculaire du chromosome39 5           Pathologies associées39 6           Conclusion                                                                                                                                                              40  Conclusions et objectifs du travail                                                                                    41                                                                                                                   ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire