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THESE présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG par Caroline PAKIN LE DOSAGE DE VITAMINES DU GROUPE B (ACIDE PANTOTHENIQUE ET COBALAMINES) DANS LES ALIMENTS APRES ISOLEMENT CHROMATOGRAPHIQUE ET DETECTION FLUORIMETRIQUE Soutenue le 26 novembre 2004 devant la Commission d'Examen Mme M. BERGAENTZLE Examinateur MM. C. BOURGEOIS Rapporteur externe C. HASSELMANN Directeur de thèse O. HEUDI Examinateur M. LEROY Rapporteur interne A. NICOLAS Rapporteur externe
- determination de l'acide pantothenique libre
- vitamines
- origines des pertes en vitamine b5
- optimisation des conditions d'hydrolyse enzymatique
- dosage de la vitamine b12 dans les aliments par couplage chromatographie
- purification des extraits par extraction en phase solide
- dérivation post-colonne
- optimisation des conditions d'hydrolyse du phosphate de ribazole en ribazole par la phosphatase
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01 novembre 2004
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33
Langue
Français
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1 Mo
THESE
présentée
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
par
Caroline PAKIN
LE DOSAGE DE VITAMINES DU GROUPE B (ACIDE PANTOTHENIQUE ET
COBALAMINES) DANS LES ALIMENTS APRES ISOLEMENT
CHROMATOGRAPHIQUE ET DETECTION FLUORIMETRIQUE
Soutenue le 26 novembre 2004 devant la Commission d’Examen
Mme M. BERGAENTZLE Examinateur
MM. C. BOURGEOIS Rapporteur externe
C. HASSELMANN Directeur de thèse
O. HEUDI Examinateur
M. LEROY Rapporteur interne
A. NICOLAS externe
Remerciements
Je remercie le Professeur Claude Hasselmann pour la façon dont il a dirigé ce travail. Je lui
suis reconnaissante de sa disponibilité et de la rigueur qu’il a toujours essayé de me transmettre,
en particulier lors de la rédaction de ce travail.
Je remercie également M. Claude Bourgeois, M. Maurice Leroy, M. Alain Nicolas et M.
Olivier Heudi de l’intérêt qu’ils ont bien voulu porter à ma thèse en acceptant de faire partie de
ce jury.
Je remercie tout particulièrement le Docteur Martine Bergaentzlé de sa disponibilité et de
ses bons conseils qui m’ont accompagné tout au long de cette thèse.
Je témoigne aussi ma reconnaissance à la société Nestlé et à l’ACTIA pour avoir financées
cette étude et au Docteur Dalal Aoudé-Werner de l’AERIAL pour sa collaboration à ce travail.
Merci aussi et surtout à toute l’équipe du Laboratoire de Chimie Analytique et Sciences de
l’aliment.
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION GENERALE .......................................................................................................... 1
CHAPITRE 1 Dosage de la vitamine B dans les aliments après isolement 5
chromatographique et dérivation post-colonne en composé fluorescent .......................................... 6
1. INTRODUCTION ......................................................................................................................................................... 6
2. MATERIEL ET METHODES........ 10
2.1. LES COMPOSES CHIMIQUES ............................................................................................................................ 10
2.1.1. Les vitamines...............................10
2.1.2. Les enzymes.................................10
2.1.2.1. La phosphatase alcaline.....10
2.1.2.2. La pantéthéinase................11
2.1.2.3. La pepsine .........................................................................................................................................................12
2.1.2.4. Les autres enzymes.............13
2.1.3. Les autres composés chimiques.13
2.1.4. La préparation des échantillons alimentaires..........................................................................................................13
2.2. LES PROTOCOLES D’EXTRACTION................................................................................................................... 14
2.2.1. L’extraction de l’acide pantothénique libre ............................................................................................................14
2.2.2. L’extraction enzymatique de l’acide pantothénique libre et lié dans le coenzyme A...........................................14
2.2.3. L’extraction enzymatique de la vitamine B totale .................................................................................................14 5
2.3. LA PURIFICATION DES EXTRAITS PAR EXTRACTION EN PHASE SOLIDE ........................................................... 15
2.4. L’ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE................................................................................................................ 15
2.4.1. L’appareillage chromatographique..........................................................................................................................15
2.4.2. La dérivation post-colonne........................................................................................................................................15
2.4.3. Les conditions chromatographiques utilisées ..........................................................................................................17
2.4.3.1. L’optimisation de la dérivation post-colonne (analyse de solutions étalons d’acide pantothénique) ...............17
2.4.3.2. L’analyse de la vitamine B dans les aliments...................................................................................................17 5
2.4.3.3. La séparation de la pantéthine, de la pantéthéine et de l’acide pantothénique.................................................17
2.5. L’EXPRESSION DES RESULTATS ...................................................................................................................... 18
2.5.1. L’expression de la teneur en vitamine B et du taux de recouvrement de la méthode.........................................18 5
2.5.2. L’analyse statistique des résultats ............................................................................................................................19
3. RESULTATS ET DISCUSSION..... 20
3.1. LA DERIVATION POST-COLONNE DE L’ACIDE PANTOTHENIQUE EN 1-(CARBOXY-ETHYL)THIO-2-
(CARBOXYETHYL)ISOINDOLE FLUORESCENT................................................................................................. 20
3.1.1. La dérivation post-colonne effectuée en deux étapes distinctes (configuration avec 2 pompes)..........................21
3.1.1.1. L’optimisation des conditions expérimentales ..................................................................................................22
3.1.1.2. La validation du mode de dérivation proposé...................................................................................................29
3.1.1.3. Conclusions.......................................................................................................................................................30
3.1.2. La dérivation post-colonne en une seule étape (configuration avec une pompe)..................................................31 3.1.2.1. L’optimisation du dispositif de dérivation à une pompe....................................................................................32
3.1.2.2. La validation du mode de dérivation proposé...................................................................................................34
3.2. LA DETERMINATION DE L’ACIDE PANTOTHENIQUE LIBRE.............................................................................. 35
3.2.1. La proposition d’une élution à gradient pour résoudre le problème des interférences
chromatographiques ..................................................................................................................................................35
3.2.2. La purification des extraits par extraction en phase solide36
3.2.2.1. Le choix du type de purification........................................................................................................................36
3.2.2.2. L’utilisation d’une cartouche échangeuse de cations : les problèmes rencontrés lors de l’analyse
d’échantillons alimentaires, leurs origines et leur résolution ...........................................................................37
3.2.3. Le dosage de l’acide pantothénique libre dans divers aliments .............................................................................41
3.3. LA DETERMINATION DE L’ACIDE PANTOTHENIQUE LIBRE ET LIE DANS LE COENZYME A............................... 44
3.3.1. L’optimisation des conditions d’hydrolyse enzymatique........................................................................................45
3.3.1.1. La préparation de la pantéthéinase...................................................................................................................45
3.3.1.2. La mesure de l’activité de la solution de la pantéthéinase................................................................................45
3.3.1.3. L’optimisation des conditions d’hydrolyse enzymatique à l’aide d’une solution étalon de coenzyme A...........47
3.3.1.4. ehydrolyse enzymatique en utilisant comme substrat un échantillon de
foie de porc .......................................................................................................................................................49
3.3.2. Les problèmes analytiques rencontrés lors du dosage de l’acide pantothénique libre et lié dans le
coenzyme A dans différents échantillons alimentaires d’origine végétale.............................................................51
3.3.2.1. Les origines des pertes en vitamine B lors de l’application du protocole analytique proposé à des 5
matrices végétales..............52
3.3.2.2. L’influence de la température d’incubation sur la teneur en acide pantothénique libre et lié..........................
