Thèse Présentée l'École Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8

  • mémoire


Thèse Présentée à l'École Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé de L'Université de Strasbourg pour obtenir le grade de Docteur de l'Université de Strasbourg par Abdellahi OULD M'HAMED OULD SIDI Production, analyse structurale et caractérisation fonctionnelle d'oncoprotéines E6 issues de différents papillomavirus Soutenue publiquement le 18.06.2009 Membres du jury : Directeur de Thèse : Dr Gilles Travé ESBS, Strasbourg Rapporteur Interne : Prof Etienne WEISS ESBS, Strasbourg Rapporteur Externe : Prof Angel ALONSO DKFZ, Heidelberg Rapporteur Externe : Dr Nicolas WOLFF I. Pasteur, Paris Examinateur : Dr Georges ORFANOUDAKIS ESBS, Strasbourg Examinateur : Dr Yves JACOB I. Pasteur, Paris

  • kinase cdki

  • e6-ap e6-associated

  • organisation mondiale de la santé orf

  • binding protein

  • neoplasia cki cdk

  • francolinus leucoscepus papillomavirus

  • e6 binding

  • cyclin dependent


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Thèse
Présentée à l’École Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé
de L’Université de Strasbourg pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université de Strasbourg
par
Abdellahi OULD M’HAMED OULD SIDI

Production, analyse structurale et caractérisation
fonctionnelle d’oncoprotéines E6 issues de différents
papillomavirus





Soutenue publiquement le 18.06.2009

Membres du jury :

Directeur de Thèse : Dr Gilles Travé ESBS, Strasbourg
Rapporteur Interne : Prof Etienne WEISS ESBS, Strasbourg
Rapporteur Externe : Prof Angel ALONSO DKFZ, Heidelberg
Rapporteur Externe : Dr Nicolas WOLFF I. Pasteur, Paris
Examinateur : Dr Georges ORFANOUDAKIS ESBS, Strasbourg
Examinateur : Dr Yves JACOB I. Pasteur, Paris
REMERCIEMENTS
REMERCIEMENTS
Les recherches qui font l’objet de ce mémoire ont été menées au sein de l’IREBS, FRE
3211 dirigée par Dr Jean-luc Galzi, dans l’équipe Oncoprotéines, dirigée par le Dr. Georges
Orfanoudakis et Dr Gilles Travé.
Qu’il me soit permis tout d’abord de remercier vivement ceux qui m’ont guidé et
soutenu pour me permettre de mener à bien ce travail pendant ces années de thèse.
En premier lieu, je tien à exprimer ma plus profonde gratitude à Dr Gilles Travé qui
m’a proposé ce sujet de thèse et m’a accompagné tout au long de sa réalisation avec beaucoup
d’intérêt. GGGGiiiilllllllleeeessss, j’ai apprécié chez toi la qualité d’un grand chercheur plein d’optimisme, ton
sens très développé de la rigueur et tes qualités humaines: esprit très ouvert, sympathie
couronnée d’une énorme modestie, et soutien. Je te remercie pour la confiance précieuse que tu
m’as accordé, pour les conseils, l’assistance morale et l’encadrement sans faille que tu as assuré
tout au long de mes années de formation et de recherches. Merci pour m’avoir aidé, soutenu et
facilité mon intégration depuis mon arrivée en France. Ma mémoire est encore fraiche, il
était minuit à la gare de Strasbourg, le temps faisait 4°C, un record de froid pour moi!, quand
tu m’as accueilli généreusement. Ce fut notre première rencontre, et depuis, cette générosité
(record elle aussi !) n’a jamais fléchi…. Que tu trouves ici le témoignage de ma reconnaissance
pour toi et ta petite famille.
Je remercie l’Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) pour m’avoir
accordé une troisième année de financement et la Société Française de Biochimie et Biologie
èmeMoléculaire (SFBBM) pour avoir financé ma participation au 33 congrès de FEBS à Athènes
(Grèce).

Je tiens également à remercier : Prof Etienne WEISS, Prof Angel ALONSO, Dr
Nicolas WOLFF, Dr Yves JACOB et Dr Georges ORFANOUDAKIS, qui ont bien voulu me
faire l’honneur de juger ce travail, en acceptant malgré leurs nombreuses activités, d’être
rapporteurs et examinateurs de ce travail, et en dépit du retard inopportun de l’envoie de
mon document dont je m’excuse au passage.
Je voudrais remercier Dr Katia ZANIER, ce travail n’aurait pas atteint son
ampleur sans toi, merci infiniment pour ta gentillesse. Nos discussions parfois animées ont
toujours été constructives et vraies. Tes connaissances, ta participation active, tes critiques et
tes conseils, ta patience et ta disponibilité durant tout le temps passé ensemble ont
énormément inspiré mon évolution professionnelle et humaine.
REMERCIEMENTS
Mes remerciements vont également à Dr Georges ORFANOUDAKIS, Dr Murielle
MMMMAAAASSSSSSSSOOOONNNN, DDDDrrrr FFFFrrrraaaannnnççççooooiiiissss DDDDEEEERRRRYYYYCCCCKKKKEEEERRRREEEE, DDDDrrrr YYYYvvvveeeessss NNNNOOOOMMMMIIIINNNNEEEE, Je vous suis reconnaissant pour
toutes les discussions et les échanges enrichissants que nous avons eus pendant toute la durée
de ma thèse. J’ai particulièrement apprécie vos dynamismes, et vos grandes réactivités face à
toutes mes interrogations et tous mes problèmes. Merci Murielle particulièrement pour la
correction d’une partie de ce manuscrit malgré ton séjour à l’hôpital.

Mes remerciements s’étendent à l’ensemble de mes amis et collègues du laboratoire,
les présents comme ceux qui sont déjà partis, pour la convivialité et la bonne humeur. Il me
faudrait plusieurs pages pour les citer tous, mais j’aimerai mentionner spécialement : le petit
champion « Barcelonais » SSSSaaaaddddeeeekkkk je te dis simplement « あ り が と う ご ざ い ま し た» pour ta
contribution à la préparation de ce manuscrit. Le jeune cristallographe Dr Sébastien,
l’estimation que j’ai eu pour toi dès le début, n’est que la diffraction de ta présence
éclaircissante dans l’équipe. Charlotte, merci pour ta contribution bien fructueuse pour nos
aventures de thèses. Merci de tout Core+1 à AAAAnnnniiiissssssssaaaa, et je te dis « choukrann » avec KKKKhhhhaaaalllleeeedddd, le
prince héritier de ma paillasse. KKaattjjaa (bioinfo), AAnnnnee, XXaavviieerr, AAnnnnee SSoo, AAuuddrreeyy, RRiimm, AAhhmmeedd KKaattjjaa AAnnnnee XXaavviieerr AAnnnnee SSoo AAuuddrreeyy RRiimm AAhhmmeedd
et kambiz un grand merci pour vos discussions divertissantes qui allègent les moments
difficiles dans le labo.
Je remercie infiniment mon professeur à Nouakchott Prof Ahmedou Ould Houmeida
pour son soutien de très longe durée, depuis mes premières années à l’université, et qui ne fait
qu’augmenter au fur et à mesure. Sans lui ne je ne serais jamais arrivé à ce niveau.
Cela va de soi, je remercie indéfectiblement mes parents, mes sœurs, frères et amis au pays. Ils
ont été présents malgré l’éloignement géographique, pour écarter les doutes, soigner les
blessures et partager les joies. Que Dieu vous protège et vous accorde chacun (e) une longue
vie. Cette thèse est un peu la vôtre aussi.
Également, je tien à remercier la petite colonie mauritanienne à Strasbourg, Khaled
Ould Kar, Sid’ahmed Chouaib, Moulay ould Hamouni, Khaled bahah, Ahmed Ould Nouman et
HHHHiiiinnnnddddoooouuuu MMMMiiiinnnntttt ZZZZeeeeiiiinnnn. C’était un immense plaisir de me retrouver entre vous.
____________________________________________________
ICI, TOUT SPECIALEMENT, AVEC AMOUR ET AFFECTION, JE VOUDRAI
ASSOCIER A CETTE THESE MON EPOUSE HOUDA MINT BABAH, SANS L’AIDE DE QUI,
JE N’AURAIS PAS PU MENER A BIEN CE TRAVAIL. MON CŒUR ET MOI NE
POURRONS JAMAIS TE REMERCIER ASSEZ POUR CE QUE TU REPRESENTES POUR
NOUS. MERCI A TOI HOUDA. ET BARAKA ALLAHOU VIK.
____________________________________________________ ABREVIATION
ABREVIATION

aa amino acid
ADN Acide Désoxyribonucléique
AP1 Activator Protein 1
ARN Acide Ribonucléique
ARNm ARN messager
ATP Adénosine 5’-triphosphate
BPV Bovine Papillomavirus
Brd4 Bromodomain containing protein 4
CBP CREB Binding Protein
cdk cyclin dependent kinase
CDK Cyclin Dependent Kinase
CDKI Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor
CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia
CKI cdk Inhibitor
CMH Complexe Majeur d’Histocompatibilité
CR Conserved Region
CRPV Cottontail Rabbit Papillomavirus
Cys cystéine
DBD DNA Binding Domain
DNA DesoxyriboNucleic Acid
DO Densité Optique
DPV Deer Papillomavirus
E Early region
E6-AP E6-Associated Protein
E6BP E6 Binding Protein
EDTA Ethylendiamintetraacetic acid
EGF Epidermal Growth Factor
EV Epidermodysplasia Verruciformis
FlPV Francolinus leucoscepus papillomavirus
GADD Growth Arrest on DNA Damage
GST Glutathione-S-Transferase
hDlg human homolog of the Drosophila melanogaster tumor suppressor
HLA Human Leucocyte Antigen
HPV Human Papillomavirus
H-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog ABREVIATION
hScrib human homolog of the D. melanogaster tumor suppressor Scribble
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
hTERT human Telomerase Reverse Transcriptase
IARC International Agency for Research on Cancer
IFN Interféron
IPTG Isopropyl-1-β-D-thiogalactopyranoside
IRF-3 Interferon Regulatory Factor 3
kDa kilo-Dalton
Kpb kilo paire de base
L Late region
LCR Long Control Region
M “molar” = 1 mol/L
MAGI Membrane Associated Guanylate kinase with Inverted domains
MAGUK Membrane Associated Guanylate Kinase
MBP Maltose Binding Protein
MDM2 Murine Double Minute 2
MUPP1 Multi PDZ domain Protein
NF-κB Nuclear Factor kappa B
NLS Nuclear Localisation Signal
NMR Nuclear Magnetic Resonance
OMS Organisation Mondiale de la Santé
ORF Open Reading Frame
ori origine de réplication
OVPV Ovine Papillomavirus
PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PCR Polymerase Chain Reaction
PDGF Platelet Derived Growth Factor
POL Phase Ouvert de Lecture
pRb protéine du Rétinoblastome
PV Papillomavirus
Rb Retinoblastoma protein
rTEV recombinant Tobacco Etch Virus protease
SDS Sodium dodecyl sulphate
siRNA small interfering RNA
Sp1 a GC box binding protein
SPR Surface Plasmon Resonance
TEV Tobacco Etch Virus ABREVIATION
TGF Transforming Growth Factor
TNF Tumour Necrosis Factor
URR Upstream Regulatory Region
VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine
YY1 protéine ying-yang 1
β-IFN interféron béta


ACIDES AMINES

A Ala Alanine
C Cys Cysteine
D Asp Aspartic acid
E Glu Glutamic acid
F Phe Phenylalanine
G Gly Glycine
H His Histidine
I Ile Isoleucine
K Lys Lysine
L Leu Leucine
M Met Methionine
N Asn Asparagine
P Pro Proline
Q Gln Glutamine
R Arg Arginine
S Ser Serine
T Thr Threonine
V Val Valine
W Trp Tryptophane
Y Tyr Tyrosine SOMMAIRE
SOMMAIRE

INTRODUCTION GENERALE ---------------------------------------------------------------- 1
Les Papillomavirus ---------------------------------------------------------------------------- 1
Classification et phylogénie des Papillomavirus ------------------------------- 2
L’évolution de papillomavirus ------------------------------------------------------ 5
Structure du virus ---------------------------------------------------------------------- 7
L’organisation génomique des papillomavirus humains ---------------------- 8
Cycle de réplication du virus HPV -------------------------------------------------- 10
Pénétration du virus ---------------------------------------------------------- 10
Infection virale productive --------------------------------------------------- 11
Infection latente --------------------------------------------------------------- 11
L’intégration de l’ADN viral au génome cellulaire -------------------- 11
Pouvoirs pathogènes des HPV --------------------------------------------------------------- 13
Histoire naturelle de l’infection à HPV ------------------------------------------------------- 16
Cancer du col de l’utérus -------------------------------------------------------------------- 16
Facteur étiologique principal -------------------------------------------------------- 18
Facteurs étiologiques secondaires (cofacteurs) -------------------------------- 20
Dépistage, traitement et la prophylaxie -------------------------------------------- 22
Les protéines virales -------------------------------------------------------------------------- 23
La protéine L1 ---------------------------------------------------------------------------- 23
La protéine L2 ---------------------------------------------------------------------------- 24
La protéine E1 ---------------------------------------------------------------------------- 26
La protéine E2 ---------------------------------------------------------------------------- 28
La protéine E4 ---------------------------------------------------------------------------- 32
La protéine E5 ---------------------------------------------------------------------------- 32
Les oncoprotéines E7 et E6 ----------------------------------------------------------- 33
La protéine E7 ------------------------------------------------------------------------------------- 34 SOMMAIRE
L’activité de E7 et ses cibles cellulaires ------------------------------------------- 34
Caractérisations biochimiques de E7 ---------------------------------------------- 38
La protéine E6 ----------------------------------------------------------------------------------- 41
La protéine E6, ses fonctions et ses cibles -------------------------------------------- 41
L’interaction E6, p53 et E6AP -------------------------------------------------------- 42
Les autres cibles de E6 ---------------------------------------------------------------- 44
E6 et Bak ------------------------------------------------------------------------ 44
E6 et Paxilline ------------------------------------------------------------------ 44
E6 et les protéines à domaines PDZ ------------------------------------- 44
E6 et E6-BP --------------------------------------------------------------------- 46
E6 et TNF-1 ---------------------------------------------------------------------- 46
E6 et E6TP-1 -------------------------------------------------------------------- 46
E6 et c-Myc ---------------------------------------------------------------------- 46
E6 et la télomérase (hTERT) ------------------------------------------------ 47
E6 et acides nucléiques: ADN et ARN ----------------------------------- 47
Conclusion sur les fonctions complémentaires de E6 et E7 --------------------------- 49
Caractérisations biochimiques de E6 ----------------------------------------------------- 49
Production et Purification de E6 --------------------------------------------------------------- 50
Tentatives échecs et d’expression de la protéine -------------------------------- 50
La purification de E6 HPV16 soluble ------------------------------------------------ 51
La prédiction de la structure secondaire des protéines E6 -------------------- 52
Structure de la protéine E6 ---------------------------------------------------------------------- 53

Présentation du projet de recherche ------------------------------------------------------ 56

RESULTATS --------------------------------------------------------------------------------------- 58
Première partie : Production et caractérisation de HPV16 E6 --------------------- 58
La purification du domaine E6-N hautement soluble ---------------------------- 58 SOMMAIRE
Identification d’une interface de dimérisation dans le domaine E6-N ------- 60
Production et caractérisation du domaine C-terminal de HPV E6 ------------- 62
Production et caractérisation de HPV 16 E6 entière ----------------------------- 64
Interaction de HPV16 E6 avec l’ubiquitine ligase E6-AP ----------------------- 67
HPV16 E6, liaison E6-AP et dégradation de p53 ---------------------------------- 67
Deuxième partie : Caractérisation biophysique de la protéine E6 de BPV ----- 71
Manuscrit 1 -------------------------------------------------------------------------------------------- 74
Troisième partie : Identification et caractérisation des protéines précoces E6,
E7 et E9 issues de papillomavirus aviaires ----------------------------------------------- 95
Manuscrit 2 -------------------------------------------------------------------------------------------- 98
Quatrième partie: l’auto-association des protéines E6 ------------------------------ 119
Manuscrit 3 ------------------------------------------------------------------------------------------- 120
DISCUSSION GENERALE ------------------------------------------------------------------- 141
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES --------------------------------------------------- 149
MATERIELS ET METHODES ---------------------------------------------------------------154
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES -------------------------------------------------- 161





INTRODUCTION







INTRODUCTION GENERALE
1