Transplantation de cellules fœtales associées ou adhérées à des microsphères libérant du GDNF (Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor) : Effets sur la survie, la différenciation et l'intégration du greffon
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE présenté par Laurence SINDJI Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Transplantation de cellules fœtales associées ou adhérées à des microsphères libérant du GDNF (Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor) : Effets sur la survie, la différenciation et l'intégration du greffon Soutenu le 21 décembre 2007 devant le jury suivant : Monsieur Verdier Jean-Michel – Président de jury Monsieur Naveilhan Philippe – Examinateur Madame Darcy-Szekely – Examinateur Monsieur Benoit Jean-Pierre – Tuteur pédagogique Madame Montero-Menei – Tuteur scientifique Laboratoire EPHE et d'accueil : Ingénierie de la Vectorisation Particulaire INSERM U646 10 rue André Boquel 49100 ANGERS Directeur EPHE : Pr Jean-Pierre BENOIT Institut national de la santé et de la recherche médicale Tuteur : Dr Claudia MONTERO-MENEI ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE TRANSPLANTATION DE CELLULES FŒTALES ASSOCIÉES OU ADHÉRÉES À DES MICROSPHÈRES LIBÉRANT DU GDNF (GLIAL CELL LINE-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR) : EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE présenté par Laurence SINDJI Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Transplantation de cellules fœtales associées ou adhérées à des microsphères libérant du GDNF (Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor) : Effets sur la survie, la différenciation et l'intégration du greffon Soutenu le 21 décembre 2007 devant le jury suivant : Monsieur Verdier Jean-Michel – Président de jury Monsieur Naveilhan Philippe – Examinateur Madame Darcy-Szekely – Examinateur Monsieur Benoit Jean-Pierre – Tuteur pédagogique Madame Montero-Menei – Tuteur scientifique Laboratoire EPHE et d'accueil : Ingénierie de la Vectorisation Particulaire INSERM U646 10 rue André Boquel 49100 ANGERS Directeur EPHE : Pr Jean-Pierre BENOIT Institut national de la santé et de la recherche médicale Tuteur : Dr Claudia MONTERO-MENEI ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE TRANSPLANTATION DE CELLULES FŒTALES ASSOCIÉES OU ADHÉRÉES À DES MICROSPHÈRES LIBÉRANT DU GDNF (GLIAL CELL LINE-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR) : EPHE Banque de Monographies SVT 1
- maladie de parkinson
- mpa
- système polymère
- gdnf
- transplantation de cellules du mésencéphale ventral
- facteurs de croissance libérés des microparticules dans les maladies neurodégénératives
- modèle animal de la maladie de parkinson
- corps cellulaire
- cellules fœtales
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE présenté par Laurence SINDJI Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes Transplantation de cellules fœtales associées ou adhérées à des microsphères libérant du GDNF (Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor) : Effets sur la survie, la différenciation et l’intégration du greffon Soutenu le 21 décembre 2007 devant le jury suivant : Monsieur Verdier Jean-Michel – Président de jury Monsieur Naveilhan Philippe – Examinateur Madame Darcy-Szekely – Examinateur Monsieur Benoit Jean-Pierre – Tuteur pédagogique Madame Montero-Menei – Tuteur scientifique Laboratoire EPHE et d’accueil: Ingénierie de la Vectorisation Particulaire INSERM U646 10 rue André Boquel 49100 ANGERS Directeur EPHE : Pr Jean-Pierre BENOIT Institut national de la santé et de la recherche médicale Tuteur : Dr Claudia MONTERO-MENEI
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE T GDNF RANSPLANTATION DE CELLULES FŒTALES ASSOCIÉES OU ADHÉRÉES À DES MICROSPHÈRES LIBÉRANT DU (GLIALCELLLINE-DERIVED NEUROTROPHICFACTOR) :
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E , ’ FFETS SUR LA SURVIE LA DIFFÉRENCIATION ET L INTÉGRATION DU GREFFON Laurence SINDJI Soutenu le 21décembre 2007 Résumé La maladie de Parkinson est une maladie qui se caractérise par une perte progressive des neurones de la substance noire et par un déficit du noyau caudé et du putamen en dopamine. Des traitements symptomatiques sont actuellement proposés pour pallier au manque de dopamine mais ils deviennent moins efficaces à long terme. La thérapie cellulaire, visant à réparer et à remplacer les neurones dopaminergiques, pourrait être une alternative de traitement de la maladie. Mais seulement 5 à 10% des cellules greffées survivent deux semaines après la transplantation. Le Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) est un facteur neurotrophique puissant capable de promouvoir la survie et la différenciation des neurones dopaminergiques du mésencéphale ventral (MV), cependant les systèmes de délivrance du GDNF, qui pourraient être appliqués à des essais cliniques, sont encore limités. Une stratégie de libération du GDNF a été développée au laboratoire basée sur l’implantation intracérébrale de microsphères de poly (lactide-co-glycolide) (PLGA), biodégradables et biocompatibles permettant un relargage prolongé du facteur neurotrophique. Pour notre projet, nous avons utilisé, dans un modèle murin de la maladie de Parkinson, deux systèmes particulaires libérant du GDNF associés à une transplantation de cellules fœtales de MV : des microsphères (MS) implantées à distance ou mélangées aux cellules fœtales et des « microcarriers pharmacologiquement actifs » (MPA) enrobés d’une molécule d’adhésion implantés en véhiculant à leur surface les cellules fœtales. Les microparticules et les cellules sont injectées par stéréotaxie dans le striatum de rat lésé par la 6-hydroxydopamine, neurotoxine spécifique des neurones dopaminergiques. L’évaluation de ces systèmes montre que les MS libérant du GDNF peuvent améliorer la survie, la différenciation et l’intégration des neurones dopaminergiques lorsqu’elles sont à distance des cellules. Les microsphères libérant ou non le GDNF transplantées avec les cellules du MV induisent plutôt une différenciation suggérant que les MS offrent un support et un environnement en 3D aux cellules. Basé sur les résultats obtenus avec les MS, le paradigme des MPA a été mis en place. Ces MPA véhiculant à leur surface les cellules fœtales du MV tout en libérant le GDNF ont permis d’augmenter la survie, la différenciation et l’intégration des cellules dans le tissu hôte. L’ensemble de ces observations permet d’avancer que les microparticules libérant du GDNF pourraient être une stratégie efficace pour des études de transplantations de cellules notamment pour le traitement de la maladie de Parkinson. Mots clés : Maladie de Parkinson, thérapie cellulaire, transplantation, GDNF, microsphère, PLGA, cellules fœtales, mésencéphale ventral, libération de facteurs de croissance TABLE DES MATIÈRES ABREVIATIONS......................................................................................................................... 6 INTRODUCTION................................................................................. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE........................................................... 1- La maladie de Parkinson.......................................................................................................... 9 1-1 Généralités......................................................................................................................... 9
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1-2 Le système dopaminergique............................................................................................... 9 1-2-1 Organisation anatomo-fonctionnelle du striatum........................................................ 9 1-2-2 Anatomie des voies dopaminergiques...................................................................... 10 1-2-3 La dégénérescence des voies nigrostriées................................................................. 11 1-3 Histologie........................................................................................................................ 11 1-4 Ethiologie........................................................................................................................ 12 1-5 Hypothèses concernant le mécanisme de la mort neuronale dans la maladie de Parkinson13 1-6 Traitements médicaux de la maladie de Parkinson........................................................... 14 1-6-1 Les traitements médicamenteux................................................................................ 15 1-6-2 Les traitements chirurgicaux..................................................................................... 16 1-6-3 La recherche thérapeutique....................................................................................... 17 1-6-3-1 La thérapie génique......................................................................................... 17 1-6-3-2 La thérapie neuroprotective............................................................................. 18 1-6-3-3 La thérapie cellulaire........................................................................................ 20 2- Modèle animal.......................................................................................................................... 23 2-1 Intérêt des modèles animaux............................................................................................ 23 2-2 Classification des modèles animaux................................................................................. 24 2-2-1 Les modèles génétiques............................................................................................ 24 2-2-2 Les modèles pharmacologiques................................................................................ 25 2-2-3 Les modèles lésionnels physiques............................................................................ 25 2-2-4 Les modèles neurotoxiques...................................................................................... 25 2-3 La 6-OHDA.................................................................................................................... 26 2-3-1 Les modèles animaux 6-OHDA............................................................................... 28 2-3-1-1 Généralités...................................................................................................... 28 2-3-1-2 Tests rotatoires................................................................................................ 29 2-3-1-3 Autres tests de comportement......................................................................... 30 2-3-2 Manisfestations histologiques.................................................................................. 31 2-3-3 Phénomènes de compensation.................................................................................. 31 3- Le GDNF(Glial cell line-derived neurotrophique factor).................................................... 32 3-1 Caractérisation biochimique............................................................................................. 32 3-2 Localisation anatomique du GDNF et de ses récepteurs.................................................. 33 3-3 Effets biologiques du GDNF........................................................................................... 34 3-4 Les différentes possibilités d’administration du GDNF................................................... 35 3-4-1 Les injections............................................................................................................ 37 3-4-2 Les pompes.............................................................................................................. 37 3-4-3 La thérapie génique................................................................................................... 38 4- Les systèmes polymères à libération contrôlée...................................................................... 40 4-1 Nature du polymère......................................................................................................... 41 4-2 Formulation pour une libération prolongée du principe actif............................................ 41 4-3 Facteurs de croissance libérés des microparticules dans les maladies neurodégénératives43 5- Combinaison de la thérapie cellulaire et de systèmes de libération dans le SNC.............. 44 5-1 Implantation de cellules et de système de libération de facteur de croissance................... 45 5-2 Le système polymère comme support matriciel................................................................ 45 6- Objectifs du projet............................................................................. MATÉRIELS ET MÉTHODES........................................................... 1- Modèle animal de la maladie de Parkinson.....................................
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1-1 La lésion................................................................................. 1-2 Evaluation de la lésion............................................................ 1-3 Contrôles histologiques.......................................................... 1-3-1 Rat non perfusé............................................................... 1-3-2 Rat perfusé...................................................................... 2- Formulation des microsphères et caractérisation............................ 2-1 MS.......................................................................................... 2-2 MPA....................................................................................... 2-2-1 Formulation..................................................................... 2-2-2 Obtention des MPA........................................................ 3- Cellules foetales du mésencéphale ventral....................................... 3-1 Dissection............................................................................... 3-2Essais biologiques.................................................................. 3-3 Adhésion des cellules du mésencéphale ventral aux MPA..... 3-3-1 Adhérence....................................................................... 3-3-2 Test de quantification de cellules adhérées aux MPA...... 4- Greffe de cellules à distance ou mélangées à des MS, ou adhérées à des MPA 4-1 Transplantation de cellules du mésencéphale ventral à distance ou mélangées aux MS 4-2 Transplantation de cellules du mésencéphale ventral adhérées aux MPA 5- Etudes immunohistochimiques........................................................ 5-1 Principe................................................................................. 6 5-2 Marquages immunohistochimiques........................................ 5-2-1 Pour la détection de la TH dans la région du striatum et de la SNc: 5-2-2 Pour la détection de GDNF, GFAP, CD11b dans la région de la greffe 6- Comptages des cellules immunomarquées, mesures des corps cellulaires, neurites et densité des fibres7- Analyses statistiques.......................................................................... RESULTATS……………………………………………………………………………………70 1- Modèle animal de la maladie de Parkinson..................................... 1-1Evaluation de la lésion............................................................ 1-2Immunohistochimie................................................................ 2- Les systèmes microparticulaires : MS et MPA................................ 2-1 Caractérisation des MS chargées de GDNF........................... 2-2 Caractérisation des MPA chargés de GDNF.......................... 2-3 Essais biologiques du GDNF libéré....................................... 2-4 Adhésion des cellules sur les MPA........................................ 3- Evaluation in vivo des deux systèmes microparticulaires.............. 3-1 Première étude : Transplantation de cellules foetales à distance ou mélangés aux MS 3-1-1 Etudes histologiques........................................................ 3-1-1-1 Libération du GDNF et réactions cellulaires.......... 3-1-1-2 Viabilité et taille des corps cellulaires..................... 3-1-1-3 Densité des fibres des neurones TH+.................... 3-1-2 Comportement rotatoire................................................... 3-2 Deuxième étude : Transplantation de cellules fœtales adhérées aux MPA
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