Les petites protéines de stress et leur rôle dans la mort cellulaire
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Description




N° d’ordre : 95 - 2004 Année 2004



THESE

présentée

devant l’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1

pour l’obtention

du DIPLOME DE DOCTORAT

(arrêté du 25 avril 2002)


présentée et soutenue publiquement le 2 juillet 2004

par


Sophie VIROT


TITRE :

Les petites protéines de stress et leur rôle dans la mort cellulaire.
Etude de leur fonction chaperon à travers l’exemple de la mutation
R120G de l’ αB-cristalline





Directeur de thèse : Pr. André-Patrick ARRIGO






Jury : M. Patrick ARRIGO Examinateur
M. William CURRIE Examinateur, Président
M. Michel MORANGE Rapporteur
Mme Claire RODRIGUEZ-LAFRASSE Exam
M. Patrick VICART

Chaque progrès donne un nouvel espoir, suspendu à la solution d’une nouvelle difficulté.


Claude Lévi-Strauss


























Je voudrais remercier ma famille, tout
particulièrement mes parents qui m’ont toujours
soutenue dans mes choix d’orientation, et qui
m’ont donné les moyens de parvenir jusque ici.
Merci à Ronique pour sa complicité, à Fred pour
nos discussions et merci à Stan pour sa
compréhension.

Je remercie Patrick Arrigo pour la liberté d’action et la confiance qu’il m’a accordée pendant ces
5 années dernières années ainsi que pour ses conseils en fin de thèse.

Je remercie Michel Morange et Patrick Vicart qui ont accepté être les rapporteurs de ma thèse et
les autres membres du jury William Currie, ...

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N° d’ordre : 95 - 2004 Année 2004 THESE présentée devant l’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1 pour l’obtention du DIPLOME DE DOCTORAT (arrêté du 25 avril 2002) présentée et soutenue publiquement le 2 juillet 2004 par Sophie VIROT TITRE : Les petites protéines de stress et leur rôle dans la mort cellulaire. Etude de leur fonction chaperon à travers l’exemple de la mutation R120G de l’ αB-cristalline Directeur de thèse : Pr. André-Patrick ARRIGO Jury : M. Patrick ARRIGO Examinateur M. William CURRIE Examinateur, Président M. Michel MORANGE Rapporteur Mme Claire RODRIGUEZ-LAFRASSE Exam M. Patrick VICART Chaque progrès donne un nouvel espoir, suspendu à la solution d’une nouvelle difficulté. Claude Lévi-Strauss Je voudrais remercier ma famille, tout particulièrement mes parents qui m’ont toujours soutenue dans mes choix d’orientation, et qui m’ont donné les moyens de parvenir jusque ici. Merci à Ronique pour sa complicité, à Fred pour nos discussions et merci à Stan pour sa compréhension. Je remercie Patrick Arrigo pour la liberté d’action et la confiance qu’il m’a accordée pendant ces 5 années dernières années ainsi que pour ses conseils en fin de thèse. Je remercie Michel Morange et Patrick Vicart qui ont accepté être les rapporteurs de ma thèse et les autres membres du jury William Currie, Claire Rodriguez-Lafrasse pour avoir accepté de juger mon travail. Je remercie tout particulièrement ceux de l’unité ou de l’extérieur avec qui j’ai collaboré ou qui m’ont aidée tout au long de ma thèse par leurs conseils, leur écoute, leur soutien ou leur motivation : l’équipe « Stress » au complet, Stéphanie G, Jocelyne, Madeleine, Michèle W, Delphine, Cécile J... Merci à Domi pour toutes nos discussions, pour les « 2D » et pour avoir pris soins de « mes » clones en fin de thèse. Merci à Carole et Chantal, Domi, Maryline et Flo pour leur bonne humeur. Merci à Nicole pour toutes nos discussions et son soutien. Je remercie l’équipe « Melhen » qui m’a régulièrement permis de « squatter » ses incubateurs cellules et qui m’a généreusement fait don de sa pompe péristaltique (j’ai gagné au moins deux ans de manips !) Merci aussi à Fred, Filipe et Sylvain pour leur précieux PC quand les mac m’ont laissée tomber. Je remercie également la ligue des pays nordiques qui m’a donné l’opportunité de présenter oralement mes travaux devant des collègues internationaux et m’a permis d’aller travailler une semaine à Åbo / Turku dans le laboratoire de John Erickson. J’en profite pour remercier Thomas Söderström qui m’a guidée tout au long de cette semaine finlandaise. J’adresse un clin d’œil aux « petits » nouveaux : Maryline, Marlène, Jérémy, Gaëtan, Greg.... et bien sur à ma promo : Véro, Seb, Orianne, Mireille, Delphine, Cécile pour tous ces moments communs de rigolade ou de faux désespoir que nous avons partagés depuis le DEA. Un grand merci à « ma logeuse » Delphine, qui m’a gentiment hébergée lors de mes retours sur Lyon en fin de thèse. Tu es la prochaine, bonne chance.... Merci aussi Vincent et Sabine, Fred, Delphine, Cécile et Manu, Cédric Ce travail n’aurait pu se faire sans le soutien du ministère de la recherche et de la Ligue Nationale Contre le Cancer qui m’ont financée pendant ces quatre années de thèse ni sans l’Association de Recherche sur le Cancer et l’Association Française de Myopathie qui ont financé les projets sur lesquelles j’ai travaillé. Merci à eux et aux généreux donateurs. Rôle des petites protéines de stress dans la mort cellulaire. Etude de leur fonction chaperon à travers l’exemple de la mutation R120G de l’αB-cristalline Plusieurs mécanismes biochimiques nécessitant des modifications de l'état d'oligomérisation ou de phosphorylation d’Hsp27 ont été proposés pour expliquer son rôle protecteur lors de stress thermique ou oxydant. Nous avons étudié les modifications biochimiques d’Hsp27 lors de l’activation de la caspase-3 et du relachage du cytochrome mitochondrial au cours de l’apoptose induite par différents stimuli. Une corrélation entre le statut biochimique et l’inhibition de la caspase-3 a été établie de même qu’une interaction entre Hsp27, Hsp70 et Apaf-1. L’αB-cristalline exerce également un rôle protecteur lors d’un stress oxydant, thermique ou apoptotique. La mutation R120G de cette protéine est responsable d’une myopathie liée à la desmine et provoquerait in vitro la perte de la fonction de type chaperon. J’ai réalisé et caractérisé des lignées cellulaires HeLa exprimant constitutivement l’αB- cristalline sauvage ou mutée et comparé leur rôle protecteur au cours de stress thermique, oxydatif et apoptotique. Les modifications des propriétés biochimiques de la protéine ont été confirmées dans le modèle HeLa et approfondies. La mutation ne semble pas modifier le réseau de filaments intermédiaires, mais affecte le cytosquelette d’actine, la mobilité et l’adhérence cellulaire. La résistance à l’apoptose n’est pas affectée, en revanche, la mutation ne protège plus des tress thermique et oxydatif. Le taux d’ions intracellulaires impliqué dans la génération des radicaux libres oxygénés est modifié par l’expression de l’αB-cristalline sauvage et mutée. 1 Small heat shock protein in cell death. Study of their chaperon-like function through the R120G αB-crystallin mutation The Small heat shock proteins Hsp27 and αB-crystallin are synthetized after many stresses. Several biochemical mechanisms including the oligomeric and phosphorylated status have been suggested to explain the protective function of Hsp27. We have analyzed the biochemical modification of Hsp27 during caspase-3 activation and mitochondrial cytochrome c release induced by several apoptotic inducers. Caspase-3 activation has been correlated with the specific biochemical status of Hsp27. An interaction between Hsp27, Hsp70 and Apaf-1 has been observed. αB-crystallin also protects against thermal, oxidative and apoptotic stresses. The R120G mutation of this protein is implicated in a desmin related myopathy and seems to alter its chaperone-like function in vitro. I have produced and characterized HeLa cell lines stably expressing wild type or mutant αB-crystallin and analyzed their protective activity during oxidative, thermal and apoptotic stresses. The mutation appears to have no effect on the intermediate filament network but alters the actin cytoskeleton, the cellular mobility and adherence. The resistance against apoptosis but not thermal or oxidative stress is not affected by the mutation. The intracellular level of iron, known to induce the reactive oxygen species, is modified when wild type or mutated αB-cristalline are express in HeLa cells. 2 Liste des abréviations aa : acide aminé ADN:Acide DésoxyriboNucléique ADP : Adénosine Di Phosphate AIF : Apoptosis Inducing Factor AK : Adénylate Kinase AMPc : Adénosine Mono Phosphate cyclique ANT : Adenosine Nucleotide Transpoter Apaf : Apoptosis protein activating factor ARNm : Acide RiboNucléique messager ATP : Adénosine Tri Phosphate BH : Bcl-2 Homology BSO : Buthionine SulfOximine CARD : Caspase Recruitment Domain CMH : Complexe Majeur d'Histocompatibilité cryo EM : cryo Electronic Mycroscopy DD : Death Domain DED : Death Effector Domain DISC : Death-Inducing Signaling Complex DNP : dinitrophenyl DRM : Desmine Related Myopathy G : glycine G6PDH : Glucose 6 Phosphate Deshydrogenase GFAP : Glial Fibrillary Acidic Protein GPx : Glutathion Peroxydase GR:GlutathionRéductase GSH : Glutathion (forme réduite) GSSG : Glutathion disuldide (forme oxydée) H O : Péroxyde d’hydrogène 2 2 HSE : Heat Shock Element 3 HSF : Heat Shock Factor Hsp : Heat shock protein IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein IL-1 : Interleukine 1 IRE : Iron Regulatory Element IRP : Iron Regulatory Protein kDa : kilo Dalton MAP kinase : Mitogen-Activated Protein kinase MAPKAP : Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated kinase MK : MAPKAP Kinase NF B : Necrosis Factor kappa B K LPS : Lipo Poly Sacharide PBS : Phosphate Buffer Salt pH : potentiel hydrogène pI:potentielIsoélectrique PKA : Protein Kinase A PKC : Protein Kinase C PTP : Permeability Transition Pore R : arginine RLO : Radicaux Libres Oxygénés S:sérine SAPK : Stress Activated Protein Kinase sHsp : small Heat shock protein SOD : Super Oxyde Dismutase SVF : Sérum de Veau Foetal TNF : Tumor Necrosis Factor UV : Ultra Violet VDAC : Voltage Dependant Anion Channel WT : Wild Type z-VAD-fmk :carbobenzoxy-VAD-fluoromethyl ketone 4 1 STRESS ET MORT CELLULAIRE ..................................................................... 13 1.1 Le choc thermique ................................................................................................................................ 13 1.1.1 Effets de l’hyperthermie sur les composants cellulaires .................................................................... 13 1.1.2 Mécanisme de protection ................................................................................................................... 14 1.2 Le stress oxydant et les radicaux libres oxygénés .............................................................................. 15 1.2.1 La genèse des RLO dans les cellules ................................................................................................. 17 1.2.2 Actions des radicaux libres oxygénés sur les composants cellulaires. ............................................... 18 1.2.3 Mécanismes de lutte contre les RLO ................................................................................................. 20 1.2.3.1 La prévention à plein temps.....................................................................................
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