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Niveau: Supérieur, Master, Bac+5

  • mémoire


MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE Ecole Pratique des Hautes Etudes section des Sciences de la Vie et de la Terre Titre du mémoire: LES CALPAÏNES MUSCULAIRES: LOCALISATION CELLULAIRE ET INTERACTION AVEC LES PROTEINES CONTRACTILES Eric FERNANDEZ Laboratoire de Biochimie Station de Recherches sur la Viande, INRA, Centre de Clermont Ferrand Theix Tel : 63122 St Genès Champanelle, France E-mail : Soutenu le devant le jury suivant Mr le Pr Jean-Marie Exbrayat Président Mr le Dr Yves Benyamin Rapporteur Mr le Dr Odile Tanguy Examinateur Mr le Dr Ahmed Ouali Examinateur Laboratoire de Motilité Cellulaire Directeur: Y. Benyamin EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • protéases actives

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  • analyse de la structure tridimensionnelle

  • famille des cystéine protéases


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MINISTERE
DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE
Ecole Pratique des Hautes Etudes
sectiondes Sciences de la Vie et de la Terre
 
Titre du mémoire: LES CALPAÏNES MUSCULAIRES: LOCALISATION CELLULAIRE ET INTERACTION AVEC LES PROTEINES CONTRACTILES  
Eric FERNANDEZ
 
Laboratoire de Biochimie Station de Recherches sur la Viande, INRA, Centre de Clermont Ferrand Theix Tel : 04 73 62 41 63 63122 St Genès Champanelle, France E-mail : ouali@clermont.inra.fr  Soutenu le devant le jury suivant Mr le Pr Jean-Marie Exbrayat Président Mr le Dr Yves Benyamin Rapporteur Mr le Dr Odile Tanguy Examinateur Mr le Dr Ahmed Ouali Examinateur Laboratoire de Motilité Cellulaire Directeur: Y. Benyamin
EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre)    
INTRODUCTION   Une cellule est constamment en train de se construire et de se détruire, c'est la définition même d'un être vivant. Les protéines essentielles au fonctionnement cellulaire sont synthétisées en continu pour fournir le stock de molécules actives. En parallèle, le processus inverse nommé catabolisme est aussi important. Les protéines impliquées dans ce phénomène fournissent des acides aminés pour la synthèse et évitent le déséquilibre entre protéines synthétisées et protéines détruites. A ce jour, quatre systèmes protéolytiques ont été identifiés dans les cellules et les tissus des mammifères : - Les calpaïnes (Protéases cytosoliques calcium dépendante) - Le protéasome (Complexe cytosolique multicatalytique ATP dépendant) - Les protéinases lysosomales (Protéases actives à pH acide) - Les sérine protéases Ces protéines nommées protéases assurent également un contrôle de la qualité protéique en éliminant les protéines mal repliées suite à des modifications génétiques, stress thermique ou oxydatif qui tendent à former des agrégats néfastes pour la cellule. Elles vont amorcer des réactions, réguler la concentration de nombreuses enzymes et intervenir dans un grand nombre d’événements cellulaires. Toutefois, la mort cellulaire produit un déséquilibre suite à l’accumulation de produits dégradés. Post-mortem,dans le tissu musculaire, ces différents systèmes protéolytiques sont impliqués dans la conversion du muscle en viande et auraient un rôle important dans le processus de tendreté. L’activité de ces enzymes est alors susceptible d’être encore régulée par des effecteurs divers dont les inhibiteurs. Des travaux sur les inhibiteurs indiquent qu’ils joueraient un rôle plus important dans le processus de maturation des viandes (Zamoraet al., 1997). Mon travail, effectué au laboratoire de biochimie au sein de la Station de Recherches sur la Viande à l’INRA de Clermont-Ferrand Theix, a consisté à étudier le système protéolytique des calpaïnes. Bien que ce système soit étudié depuis une longue période, de nombreuses questions restent irrésolues. Avant d’apporter quelques éléments de réponse concernant leur localisation dans la cellule musculaire, ou leur interaction avec d’autres éléments myofibrillaires, nous ferons un point bibliographique sur la famille des calpaïnes ainsi que sur les autres systèmes protéolytiques.    
 LE SYSTEME CALPAÏNE
I- Les calpaïnes ubiquitaires 1 - Introduction Découvertes en 1964 par Guroff, les calpaïnes font partie de la famille des cystéine protéases. Elles sont rapidement décrites comme des Protéases Neutres à Activités Calcium dépendantes (CANP : Calcium Activated Neutral Proteases). Au sein des calpaïnes, on distingue différents groupes. La m -calpaïne et la m-calpaïne encore appelées calpaïnes 1 et 2 (d’après leur ordre d’élution sur colonne chromatographique de type DEAE) sont les plus étudiées et font partie du groupe des calpaïnes ubiquitaires. C’est leur exigence en calcium qui différencie ces deux protéases, l’une étant active pour des concentrations de l’ordre du m Molaire l’autre de l’ordre du mMolaire. A noter la purification d’une autre forme ubiquitaire, intermédiaire aux deux précédentes sur la sensibilité au calcium. Cette forme est nomméeµ/m-calpaïne (Sorimachiet al., 1995a). Le fait que les calpaïnes soient exprimées dans tout l’organisme suggère leur importance dans des fonctions cellulaires essentielles.  2 - Structure des calpaïnes ubiquitaires Les calpaïnes 1 et 2 forment un hétérodimère de masse moléculaire de 110 kDa. Chaque protéine est constituée de deux sous unités; une grande de 80 kDa et une petite de 30 kDa. Bien que les deux grandes sous-unités de ces calpaïnes aient une structure différente, elles présentent néanmoins 50% d’homologies. 2.1 La grande sous-unité La grande sous-unité encore nommée µCLou mCL (pour µ ou mCalpaïneLarge sous-unité) peut être divisée en quatre domaines (Fig. 1a). Dans ce monomère, ce sont les domaines II et IV qui caractérisent la protéine. Le domaine II correspond au domaine cystéine protéase avec les résidus catalytiques cystéine (C), histidine (H), et asparagine (N) et montre une très grande similitude avec les autres cystéine protéases. Le domaine IV quant à lui, présente des motifs nommés EF-hand capables de lier les ions calcium. Ces motifs EF hand, définis par Kretsinger, consistent en une hélice alpha, suivie d’une boucle de liaison du calcium, et à nouveau d’une hélice alpha (Kretsingeret al., 1973; Tuftyet al., 1975). De nombreuses protéines liant les ions calcium possèdent ces motifs telles que la calmoduline ou la troponine C et peuvent ainsi être regroupées au sein d'une superfamille ayant la même origine (Ohno et al., 1984). Comme ces motifs de liaison au calcium ont été observés pour la première fois chez la calmoduline, le domaine IV est souvent nommé " calmodulin-like ". Les domaines II et IV sont à l’origine du nom de la protéine, "cal" pour Calmoduline et "païn" pour Papaïne, enzyme souvent prise comme modèle de la famille des cysteine protéases. Les domaines I et III ne présentent aucune similitude de séquence avec les autres protéines dont la structure primaire a été établie. Ces domaines participeraient à la structure spatiale des calpaïnes, structure qui va influencer leur activité hydrolytique. La modification de la partie N-terminale du domaine I semble ainsi augmenter la sensibilité au calcium (Suzukiet al., 1981a). De même, on note dans la partie N-terminal du domaine III un motif EF-hand capable de lier le calcium (Andresenet al domaines demeurent encore peu comprises.., 1991). A ce jour, les fonctions de ces deux derniers
La structure tridimensionnelle de la large sous-unité à été récemment élaborée pour la m-calpaïne (Fig. 1b). Ces travaux sur la structure tridimensionnelle de la calpaïne II (complexe des deux sous-unités) confirment la proximité des deux domaines de liaison du calcium IV (sous-unité de 80 kDa) et VI (sous-unité de 30 kDa) et leur rôle dans l’association des deux sous-unités de la calpaïne suggéré par d’autres approches. Le domaine II de la grande sous-unité ou domaine catalytique est situé au-dessus, il est composé de deux sous domaines séparés par une ouverture qui correspond au site actif de l’enzyme (fig. 1b). Enfin, le domaine III de la grande sous-unité assure la liaison entre les domaines II et IV de cette entité. Concernant la sous-unité de 30 kDa, il est intéressant de noter que le domaine N-terminal (Domaine V) semble interagir avec le domaine II de la grande sous-unité. 2.2 La petite sous-unité En ce qui la concerne, cette sous-unité a une masse de 30 kDa (Fig. 1a), et a comme particularité d’être commune aux deux protéines (Kawasakiet al., 1986). Elle possède deux domaines appelés V et VI. Le domaine V possède un grand nombre de résidus glycine et aurait une importance dans la liaison des calpaïnes aux membranes (Imajohet al., 1986b). Le domaine VI est encore nommé IV’ car il est hautement similaire au domaine "calmodulin-like" de la grande sous-unité.  2.3 Particularités des Domaines de liaison du calcium (Domaines IV et IV') Les premières études sur ces domaines ont montré qu’ils étaient hautement similaires chacun possédant quatre motifs EF-hand nommés de EF1 à EF4 (Emoriet al., 1986a et b). Par l’intermédiaire de ces motifs, les domaines IV et IV’ ont la possibilité de lier le calcium mais l'affinité des ions calcium vis-à-vis de chaque motif EF-hand varie en fonction de chaque domaine (Minamiet al., 1987). En 1991, Andresen caractérise une nouvelle molécule d'ADN complémentaire chez le parasiteSchistosoma mansoni à la large. Cette séquence coderait pour une protéine similaire sous-unité et présente la particularité de posséder un motif EF-hand (EF6) entre le domaine II et III. Ce motif capable de lier le calcium s ’avère être présent chez toutes les calpaïnes (Andersenet al., 1991). De même, en 1995, Theopold note la présence dun autre motif EF-hand dans la région N-terminal de EF2. Ce motif est alors nommé EF1et porte à 5 le nombre de sites pouvant lier le calcium dans les domaines IV et IV' (Theopoldet al1995). Au total, on dénombre chez les calpaïnes., µet m, 11 motifs EF-hand par molécule. Plus récemment, la structure tridimensionnelle de la petite sous-unité a été déterminée (Linet al., 1997; Blanchardet al., 1997). Cette détermination a permis de montrer que les motifs EF-hand fonctionnaient par paires ; EF1 et EF2 ayant une conformation ouverte, tandis que les motifs EF3 et EF4 ont une conformation fermée. L’analyse de la structure tridimensionnelle a également montré que le motif EF5 ne semble pas lier le calcium et il apparaît responsable de la formation de l’hétérodimère. Mais la nouveauté réside dans le fait que le motif EF5 serait également capable d’interagir avec son double pour former des homodimères à la fois pour la grande et la petite sous-unité (Kretsingeret al., 1997).  3 - La Calpastatine 3.1 Structure La calpastatine est l’inhibiteur endogène spécifique des calpaïnes. Vers la fin des années 1990, le clonage d’ADN complémentaire de la calpastatine chez diverses espèces, humain (Asadaet al., 1989), porc (Tanakoet al., 1988), lapin (Emoriet al., 1987), bovin (Killefer et Koohmaraie, 1994) a permis de déterminer le nombre d’acides aminés, qui est d’environ 700.