ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

Virginie Lamy

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE DE STRASBOURG ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESE pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE STRASBOURG Discipline : Sciences du Vivant Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie présentée et soutenue publiquement par Mademoiselle Virginie LAMY Le 29 octobre 2009 Titre : ETUDE DES PROPRIÉTÉS ANTI-CANCÉREUSES DES LUPULONES, MICRO CONSTITUANTS SPECIFIQUES DU HOUBLON : ASPECTS CELLULAIRES ET PHYSIOPATHOLOGIQUES Directeur de Thèse : Dr. F. RAUL Membres du jury : Dr. Michèle KEDINGER Examinateur Pr. Jean-Louis GUÉANT Rapporteur Externe Pr. Norbert LATRUFFE Rapporteur Externe Dr. Jocelyn CERALINE Rapporteur Interne Dr. Francis RAUL Directeur de Thèse

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Sujets

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• Cancer Cell

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 octobre 2009
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• Langue: English
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Extrait

UNIVERSITE DE STRASBOURG ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESE

pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE STRASBOURG Discipline : Sciences du Vivant Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie

présentée et soutenue publiquement par Mademoiselle Virginie LAMY Le 29 octobre 2009 Titre : ETUDE DES PROPRIÉTÉS ANTI-CANCÉREUSES DES LUPULONES, MICRO CONSTITUANTS SPECIFIQUES DU HOUBLON : ASPECTS

CELLULAIRES ET PHYSIOPATHOLOGIQUES Directeur de Thèse : Dr. F. RAUL

Membres du jury :

Dr. Michèle KEDINGER Pr. Jean-Louis GUÉANT Pr. Norbert LATRUFFE Dr. Jocelyn CERALINE Dr. Francis RAUL

Examinateur Rapporteur Externe Rapporteur Externe Rapporteur Interne Directeur de Thèse

SUMMARY Colorectal cancer is the third most predominant cause of cancer-related death. It has been demonstrated that the consumption of fruits and vegetables contributes to a reduced risk of developing colon cancer. This has been attributed to the presence of bioactive molecules showing high chemopreventive properties. The bitter acids of hops are divided into two main categories, humulone or alpha-acid and lupulone or beta-acid. To date various potent biological properties have been reported for humulones while no information were available on the biological properties of lupulone. The objectives of this thesis were to compare death signalling pathways triggered by lupulone in the human colon adenocarcinoma SW480 cells and in their derived-metastatic SW620 cells as well as to assess their chemopreventive effects in a preclinical model of colon carcinogenesis in rats. Our data showed that lupulone induced apoptosis by activating different death pathways in SW480 cells and in SW620 cells. In the TRAIL-sensitive SW480 cells, lupulone activated TRAIL death receptors DR4 and DR5, initiating extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. In response to lupulone, SW480 cells activate the MAPK ERK and mutated-p53 pathways, inducing the activation of cancer cell survival mechanisms. In TRAIL-resistant metastatic SW620 cells, lupulone restored the sensibility of these cells to TRAIL ligand and activated mainly the MAPK p38 pathway,

inducing the activation of TRAIL death receptors DR4 and DR5 and the extrinsic apoptotic pathway. In these cells the MAPK p38 pathway activated mutated-p53, which played a pro- apoptotic role. In response to lupulone, SW620 cells showed an activation of the NF-κB factor, which might up regulate the Mcl-1 protein expression favouring mitochondrial stabilization. In the preclinical model of colon carcinogenesis in rats, lupulone (0,4 or 8 mg/kg body weight) administered in the drinking water was able to cause a drastic diminution in the number of preneoplastic lesions (aberrant cryot foci) and in the number of primary tumors. In conclusion, lupulone appears to be a promising chemopreventive/therapeutic agent with potent anti-tumoral properties on colorectal cancer. Our present data support the use of lupulone in colon cancer chemoprevention trials.

REMERCIEMENTS Je remercie tout d’abord le Professeur Jacques Marescaux pour son accueil au sein de l’Institut de Recherche contre les Cancers de l’Appareil Digestif (IRCAD) et la mise à disposition des moyens nécessaires à la bonne réussite de ce projet de thèse des Sciences de la Vie. Je remercie les membres du Jury, le Docteur Michèle Kedinger, le professeur Jean-Louis Guéant, le professeur Norbert Latruffe et le docteur Jocelyn Céraline pour avoir accepté de juger ce travail de thèse et de contribuer ainsi à l’obtention de mon diplôme. Je remercie tout particulièrement mon directeur de thèse, le docteur Francis Raul. Je vous serai toujours reconnaissante de m’avoir accordé autant de confiance pour mener ce projet à bien. Merci pour tous vos précieux conseils, pour votre disponibilité et vos magnifiques qualités humaines. Un grand merci pour avoir su me guider lors des moments de doutes ou de dispersion ainsi que pour vos précieuses corrections de manuscrits, les rendant d’un coup beaucoup plus compréhensibles. Ces trois années passées dans ce laboratoire ont été riches en expériences professionnelles et humaines et resteront inoubliables. Un grand merci pour la personne centrale du laboratoire, Madame Francine Gossé. Je tiens à vous remercier pour votre dévouement permettant à cette équipe d’avancer toujours sereinement dans une si bonne ambiance. Merci pour votre disponibilité, vos conseils, votre gentillesse et pour tout le temps passé de la formation à la culture cellulaire jusqu’à la correction de ma thèse. Je remercie également Mlle Souad Boussarouel, pour avoir accordé de son temps afin de développer les expériences en RT-PCR ainsi que pour tous ses conseils et ses explications durant l’avancement du projet. J’adresse également tous mes remerciements à l’équipe de pharmacognosie du Dr Annelise Lobstein sans qui la purification des extraits de lupulones n’aurait pas été possible. Merci pour votre accueil, votre générosité et votre sympathie pendant mes brefs passages dans votre laboratoire. Je remercie chaleureusement les brasseries Carlsberg et plus particulièrement le Dr Behnam Taidi, pour la mise à disposition de la matière première enrichie en lupulones et sa

collaboration au projet, ainsi que la Région Alsace pour avoir soutenu financièrement mon projet. Des remerciements tous particuliers pour ma chère collègue, Madame Maria-Elena Maldonado-Celis. Que dire si ce n’est que cette rencontre est une des plus jolies de ma vie. Nous avons partagé les mêmes doutes, les mêmes difficultés, les mêmes stress et les mêmes joies durant ces trois années de doctorat. Un grand merci pour tous tes conseils et pour tes sacrifices afin de m’accompagner pendant les pauses café… Merci également pour avoir apporté un peu d’exotisme et pour m’avoir initiée à quelques coutumes de la Colombie. J’espère qu’on gardera contact et que je pourrai venir découvrir ce pays que tu aimes tant. Bien évidemment je me dois de remercier celle qui m’a tout appris pendant ma première année et qui m’a permis de trouver très rapidement mes marques dans le laboratoire, Mlle Stamatiki Roussi dite Matina. Je pense que tu dois être une des seules personnes avec qui j’ai développé une complicité aussi forte si vite. Merci pour m’avoir appris à dompter le cytomètre en flux. Merci pour ton dynamisme, pour avoir partagé tes compétences, pour nos nombreux délires, et tout simplement pour être comme tu es. Je ne peux pas finir sans remercier de tout mon cœur, tous mes amis proches, ma famille et surtout mes parents. Merci à tous les deux d’avoir cru en moi et de m’avoir permis d’être arrivée jusque là. Merci pour votre soutien, si important à mes yeux, durant toutes ces années d’études même lors des périodes difficiles de doutes. Merci d’avoir fait de moi ce que je suis, je vous aime. Je souhaite également remercier tout particulièrement mon chéri, Thomas. Merci de m’avoir toujours encouragée pendant la thèse, de m’avoir soutenue et rassurée lors de moments de faiblesse et de stress. Merci d’être toujours là, de m’épauler et de me pousser vers le haut. Je ne serai jamais arrivée aussi facilement jusque là sans toi, merci de tout mon cœur, je t’aime. Enfin, je remercie toutes les personnes qui ont participé de près ou de loin à ce projet, tout le personnel de l’IRCAD et tous ceux que j’ai pu oublié dans ces quelques lignes.

SOMMAIRE

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SOMMAIRE INDEX DES FIGURES ........................................................................................................... 5 LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................... 7 OBJECTIFS.............................................................................................................................. 9 INTRODUCTION .................................................................................................................. 11 I. LE CANCER COLORECTAL ...................................................................................... 11 1. Epidémiologie du cancer colorectal .......................................................................... 11 2. La cancérogenèse colique........................................................................................... 13 3. Traitements du cancer colorectal.............................................................................. 15 3.1. Dépistage et diagnostic........................................................................................ 15 3.2. Traitements .......................................................................................................... 16 II. LA MORT CELLULAIRE ........................................................................................... 18 1. Généralités .................................................................................................................. 18 2. L’apoptose................................................................................................................... 23 2.1. Généralités ........................................................................................................... 23 2.2 Les caspases .......................................................................................................... 24 2.2.1 Description ...................................................................................................... 24 2.2.2 Régulation des caspases .................................................................................. 25 2.3 La famille des protéines Bcl-2 ............................................................................. 26 2.3.1. La protéine pro-apoptotique Bid.................................................................... 27 2.3.2 La protéine pro apoptotique Bax.................................................................... 28 2.3.3 Les protéines anti-apoptotiques Bcl2 et Mcl-1 ............................................... 28

2.4. La voie intrinsèque ou mitochondriale.............................................................. 29 2.4.1 La perméabilisation mitochondriale................................................................ 30 2.4.2 Formation de l’apoptosome............................................................................. 32 2.5. La voie extrinsèque de mort cellulaire .............................................................. 33 2.6. Le stress oxydatif ................................................................................................. 35 2.7. La fragmentation de l’ADN................................................................................ 36 2.8. La régulation de l’apoptose ................................................................................ 37

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2.8.1 Les voies MAP kinases (Figure 13) ................................................................ 37 2.8.2 La protéine p53 (Figure 13) ........................................................................... 38 2.8.3 Le facteur NF-κB (Figure 13)......................................................................... 39 III. LA CHIMIOPREVENTION ....................................................................................... 41 1. Définition de la chimioprévention............................................................................. 41 2. Identification et propriétés anti-cancérogènes des agents chimiopréventifs ....... 43 IV. LES CONSTITUANTS DU HOUBLON : COMPOSITION CHIMIQUE ET PROPRIETES BIOLOGIQUES............................................................. 46 1. La plante du houblon ................................................................................................. 46 2. La composition chimique des cônes de houblon ...................................................... 47 2.1. Composition chimique des résines dures de la lupuline .................................. 47 2.1.1. Les flavonoïdes .............................................................................................. 47 2.2 Composition chimique des résines molles de la lupuline .................................. 49 2.2.1 Les acides amers du houblon .......................................................................... 49 2.3. Les huiles essentielles .......................................................................................... 49 3.1. Prévention de l’initiation de la cancérogenèse.................................................. 51 3.1.1. Inhibition de l’activation métabolique des procarcinogènes .......................... 51 3.1.2. Induction d’enzymes de détoxification .......................................................... 51 3.1.3. Capture des espèces réactives à l’oxygène..................................................... 52

3.2. Prévention de la promotion du cancer .............................................................. 52 3.2.1. Effets anti-inflammatoires des constituants du houblon ................................ 53 3.2.2. Inhibition de l’angiogenèse ............................................................................ 53 3.3. Prévention de la progression du cancer ............................................................ 54 3.3.1. Effets anti-prolifératifs des composés du houblon ......................................... 54 3.3.2. Apoptose induite par les composés du houblon ............................................. 55 METHODOLOGIES ............................................................................................................. 60 I. ETUDES DE BIOLOGIE CELLULAIRE .................................................................... 60 1. Les lignées cellulaires SW480 et SW620 .................................................................. 60 2. Molécules testées......................................................................................................... 60 2.1 Extraction et purification des lupulones ............................................................ 60

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2.2 Autres molécules testées....................................................................................... 61 3. La cytométrie en flux ................................................................................................. 62 3.1 Principe général de la technique ......................................................................... 62 3.2 Analyse de la mort cellulaire : apparition des corps hypodiploïdes ................ 64 3.3 Mesure de la production du stress oxydatif ....................................................... 65 3.4 Mesure du potentiel transmembranaire mitochondrial ................................... 66 3.5 Analyse de la fragmentation de l’ADN............................................................... 66 4. Analyse de l’expression des ARNm par RT-PCR en temps réel............................ 67 5. Principe des tests colorimétriques et des tests ELISA ............................................ 69 5.1 Tests colorimétriques ........................................................................................... 69 5.2 Le test ELISA ....................................................................................................... 70 II. MODELE PRECLINIQUE DE CANCEROGENESE EXPERIMENTALE .......... 71 1. Modèle animal et traitements .................................................................................... 71 2. Mesure et détermination des cryptes aberrantes et des tumeurs coliques............ 72 RESULTATS EXPERIMENTAUX ..................................................................................... 74 CHAPITRE 1 :Etudes des effets chemopréventif des lupulones sur les cellules cancéreuses coliques humaines métastatiques SW620, ainsi que sur un modèle de cancérogenèse colorectale chez le rat ................................... 74 1. Résumé ....................................................................................................................... 75 2. Introduction ................................................................................................................ 76 3. Résultats : PUBLICATION n°1................................................................................ 77 4. Conclusion................................................................................................................... 78 CHAPITRE 2 :Les lupulones activent différentes voies de mort cellulaire, impliquant les récepteurs apoptotiques de la voie TRAIL....................................... 79 1. Résumé ........................................................................................................................ 80 2. Introduction ................................................................................................................ 81 3. Résultats : PUBLICATION n° 2............................................................................... 82 4. Résultats complémentaires ........................................................................................ 83 4.1 Effets des lupulones sur l’expression des ARNm de DR4 et DR5.................... 83 4.2. Détermination de l’expression des protéines Bcl2, Mcl-1 et Bax .................... 85

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4.3. Analyse de la fragmentation d’ADN induite par les lupulones....................... 87 4.4 Etude d’un membre de la famille des inhibiteurs naturels de l’apoptose IAP : XIAP ............................................................................................................................ 88 5. Conclusion................................................................................................................... 90 CHAPITRE 3 :Rôles de la protéine p53 mutée et du facteur de transcription NF-κB dans l’induction de la mort cellulaire par les lupulones. ...................... 91 1. Résumé ........................................................................................................................ 92 2. Introduction ................................................................................................................ 93 3. Résultats : PUBLICATION n° 3............................................................................... 95 4.1. Détermination du rôle du facteur de transcription NF-κB........................... 122 5. Conclusion................................................................................................................. 125 CHAPITRE 4 :Implication des voies de signalisation MAP kinases dans l’induction de l’apoptose par les lupulones. ................................................................. 127 1. Résumé ...................................................................................................................... 128 2. Introduction .............................................................................................................. 129 3. Résultats : PUBLICATION n°4.............................................................................. 131 4. Résultats complémentaires sur la lignée SW480 ................................................... 153 4.1. Analyse de la mort cellulaire après inhibition des voies MAPK................... 153 4.2 Expression de la protéine p53 après inhibition de la voie ERK..................... 154 5. Conclusion................................................................................................................. 156 DISCUSSION GENERALE ............................................................................................. 158 I. Activation par les lupulones, des voies de signalisation des récepteurs apoptotiques de TRAIL ............................................................................................... 158 II. Régulation de l’apoptose induite par les lupulones.............................................. 161 III. Effets des lupulones sur un modèle pré-clinique de cancérogenèse expérimentale................................................................................................................ 167 IV. Conclusion générale ............................................................................................... 168 REFERENCES BLIOGRAPHIQUES ............................................................................... 171 PARTICIPATIONS ............................................................................................................. 189

INDEX des figures

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INDEX DES FIGURES Figure 1............................................................................... 12: Mortalité par cancer en France Figure 212: Estimation de nouveaux cas de cancer en 2002 et mortalité. .................................. Figure 3: Les différents stades du cancer colorectal ............................................................... 14 Figure 4: Caractéristiques morphologiques de la nécrose et de l'apoptose. ............................ 20 Figure 521: Le processus de l'autophagie.................................................................................... Figure 6: Mécanismes de la catastrophe mitotique et de la sénescence .................................. 22 Figure 7: Schéma de l'activation des caspases ........................................................................ 25 Figure 8: Les protéines de la famille Bcl-2 ............................................................................. 27 Figure 930: Schéma de la voie intrinsèque ................................................................................. Figure 10: Chaîne respiratoire et perméabilisation mitochondriale ........................................ 31 Figure 11: Assemblage de l'apoptosome ................................................................................. 33 Figure 12............................................... 34: Lien entre les deux voies principales de l'apoptose Figure 13: Les voies majeures de la régulation de l'apoptose ................................................. 40 Figure 14: Différents agents alimentaires chimiopréventifs ................................................... 42 Figure 15: Action des composés chimiopréventifs sur la cancérogenèse ............................... 44 Figure 16: La plante femelleHumulus Lupulus...................................................................... 46 Figure 1748: Formation des flavonones prénylées et du xanthohumol....................................... Figure 18: Structures chimiques des acides amers du houblon............................................... 50 Figure 1957: Mécanismes d'action de l'induction de l'apoptose par les acides amers ................ Figure 2058: Les cibles potentielles du xanthohumol lors de l’induction de l'apoptose............. Figure 21........................................................................... 63: Principe de la cytométrie en flux Figure 22: Analyse du cycle cellulaire des cellules SW480 et SW620................................... 64 Figure 23: Mécanisme d'action du 2', 74-dichlorohydrofluorescéine (HDCF-DA)................ 65 Figure 2467: Principe de la méthode TUNEL............................................................................. Figure 25: Principe de la chimie Taqman en PCR en temps réel ............................................ 68 Figure 2669: Profil d'une courbe de PCR en temps réel ............................................................. Figure 27............................................................ 70: Principe simplifié de la méthode "ELISA" Figure 28: Analyse de l'expression relative des ARNm de DR4 et DR5 ................................ 84 Figure 29: Expression des protéines Bcl-2, Mcl-1 et Bax après traitement aux lupulones8.....6 Figure 3087: Induction de la fragmentation d'ADN par les lupulones ....................................... Figure 31: Détection de la protéine XIAP en présence de lupulones...................................... 89