Étude des calpaïnes : Leurs rôles et leurs régulations au cours de la régénération musculaire.

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Niveau: Supérieur, Master, Bac+5
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Carole JOND-NECAND Pour l'obtention du Diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Étude des calpaïnes : Leurs rôles et leurs régulations au cours de la régénération musculaire. Soutenu le 4 novembre 2005 à Montpellier devant le jury suivant : Monsieur le Docteur Norbert KOENIG Président Monsieur le Docteur Stephen BAGHDIGUIAN Rapporteur Madame le Docteur Anne MARCILHAC Examinatrice Monsieur le Docteur Fabrice RAYNAUD Examinateur Laboratoire EPHE de Motilité Cellulaire UMR 5539 (cc 107), Place Eugène Bataillon 34095 Montpellier Cedex 05 Directeur du laboratoire : Dr BENYAMIN Yves () Tuteur pédagogique : Dr MARCILHAC Anne () Tuteur scientifique : Dr RAYNAUD Fabrice () ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES EPHE Banque de Monographies SVT 1

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  • régénération musculaire

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  • fonctions des calpaïnes dans la cellule

  • basic helix-loop-helix

  • turn-over des protéines et de la fusion des myoblastes

  • régulation par le calcium


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Publié le 01 novembre 2005
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Langue Français

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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE
LA RECHERCHE

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

Sciences de la Vie et de la Terre



MEMOIRE

présenté par

Carole JOND-NECAND

Pour l’obtention du Diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes


Étude des calpaïnes :
Leurs rôles et leurs régulations au cours de la
régénération musculaire.



Soutenu le 4 novembre 2005 à Montpellier devant le jury suivant :


Monsieur le Docteur Norbert KOENIG Président le Stephen BAGHDIGUIAN Rapporteur
Madame le Docteur Anne MARCILHAC Examinatrice
Monsieur le Fabrice RAYNAUD Examinateur


Laboratoire EPHE de Motilité Cellulaire
UMR 5539 (cc 107), Place Eugène Bataillon
34095 Montpellier Cedex 05

Directeur du laboratoire : Dr BENYAMIN Yves (benyamin@univ-montp2.fr)
Tuteur pédagogique : Dr MARCILHAC Anne (marcilhac@univ- scientifique : Dr RAYNAUD Fabrice (raynaudf@univ-montp2.fr)

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
EPHE Banque de Monographies SVT 1
Sciences de la Vie et de la Terre


Étude des calpaïnes :
Leurs rôles et leurs régulations au cours
de la régénération musculaire

Carole Jond-Nécand


Résumé


Les calpaïnes, protéases à cystéine calcium-dépendante, sont présentes dans presque tous les
types cellulaires. Cette famille est composée de 14 membres dont certains sont ubiquitaires (ex :
Calpaïnes 1 et 2) et d’autres sont tissus-spécifiques (ex : Calpaïne 3 dans le muscle).
Les calpaïnes sont impliquées dans de multiples fonctions cellulaires telles que la migration
cellulaire, l’apoptose, le cycle cellulaire… Celles-ci jouent également un rôle dans le muscle
squelettique notamment au niveau de la régénération musculaire, du turn-over des protéines et de la
fusion des myoblastes. Il a aussi été décrit que leur dérégulation par une entrée massive de calcium
dans la cellule (ischémies, dystrophies musculaires) entraîne une protéolyse rapide du cytosquelette.
Ce diplôme a pour but d’étudier les régulations possibles des calpaïnes et de leurs substrats
par les phosphorylations et dans un deuxième temps, l’implication de la calpaïne 2 dans la
progression du cycle cellulaire et plus particulièrement au cours de la mitose des myoblastes.
Nous nous sommes intéressés dans un premier temps aux mécanismes impliqués dans la
régulation de l’activation des calpaïnes. La régulation par le calcium n’étant pas suffisante pour tout
expliquer, nous nous sommes focaliser sur l’implication des phosphorylations dans cette activation.
Nous avons plus particulièrement étudié l’effet des phosphorylations sur un substrat de la calpaïne 1 :
la gamma-filamine. Nous avons conclut quant au rôle protecteur de la phosphorylation de la gamma-
filamine vis-à-vis de la protéolyse par la calpaïne 1.
Dans un second temps, nous avons porté notre attention sur le rôle de la calpaïne 2 dans le
cycle cellulaire et donc sur la régénération musculaire grâce à l’utilisation de la technique du SiRNA.
Cette technique appliquée sur notre modèle cellulaire, les C2.7, a permis de mettre en évidence une
mauvaise ségrégation des chromosomes et une séparation précoce des chromatides sœurs lors de la
déplétion de la calpaïne 2.


Mots-clés : Calpaïne, Muscle, C2.7, Cytosquelette, Phosphorylation, Filamine,
Différenciation, SiRNA, Mitose.

Table des matières

INTRODUCTION

Introduction générale 1
EPHE Banque de Monographies SVT 2
I ) Les calpaïnes 2
A ) Structure des calpaïnes 3
1 ) Calpaïnes ubiquitaires 3
2 ) Calpaïne 3 ou p94 5
B ) Régulations des calpaïnes 5
1 ) Par le calcium 6
2 ) Par la calpastatine, inhibiteur des calpaïnes 6
3 ) Par les phosphorylations 7
C ) Fonctions des calpaïnes dans la cellule 8
1 ) Localisation 10
2 ) Relation avec le cytosquelette 11
3 ) Signaux de transduction 13
4 ) Cycle cellulaire et apoptose 14
5 ) Régulation de l’expression génétique 16
D ) Pathologies liées aux calpaïnes 17

II ) Le tissu musculaire 19
A ) Structure et composants 19
1 ) Les myofibrilles 20
2 ) Le réticulum sarcoplasmique 22
3 ) Les structures transverses 23
4 ) La filamine 23
B ) Cellules myogéniques et myofibrillogenèse 26

III ) Les calpaïnes dans le muscle 31
A ) Localisation 31
B ) Régulations 31
C ) Fonctions 33
D ) Pathologies musculaires liées aux calpaïnes 35











EPHE Banque de Monographies SVT 3
































Liste des abréviations

A/T/C/G : Adénine/Thymine/Cytosine/ Guanine
ABP : Actin Binding Protein
ADN : Acide Désoxyribonucléique
ADNc : Acide complémentaire
ADP : Adénosine DiPhosphate
APC : Anaphase Promoting Complex
ARN : Acide Ribonucléique
ARNm : Acide messager
EPHE Banque de Monographies SVT 4ATP : Adénosine 5’ TriPhosphate
BCIP : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate
BET : Bromure d’éthidium
bHLH : basic helix-loop-helix
BrDU : Bromodéoxyuridine
BSA : Bovine Albumine Serum
Cdc : Cell division cycle
Cdk : Cyclin dependent kinase
CHAPS : Cholamidopropyl dimethylammonio-1-propanesulfonate
DAPI : Diaminophénylindane
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Media
DMSO : Diméthylsulfoxide
DO : Densité Optique
dsRNA : double stranded RNA
DTT : Dithiothréitol
ECL : Enhanced ChimiLuminescence
EDTA : Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid
EGFR : Epidermial Growth Factor Receptor
EGTA : Ethylene Glycol Tetra-acetic Acid
ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase
FITC : Fluoresceine Isiothiocyanate
GTP : Guanosine TriPhosphate
HGF : Hepatocyte Growth Factor
IEF : Isoélectrofocalisation
IF : Immunofluorescence
IgG : Immunoglobuline
IP : Immunoprécipitation
IS : Domaine d’insertion
kDa : Kilo Dalton
Kd : Constante de dissociationapp
LB : Luria Bruth
LGMD2A : Limb Girdle Muscular Dystrophy
M : Mole par litre
mA : Milli Ampère
Mad : Mitotic Arrest Deficient
MAPK : Microtubule Associated Protein Kinase
MARCKS : Myristoylated Alanine Rich C Kinase Substrat
MEEK 1 : MAP / ERK Kinase Kinase 1
miRNA : micro interfering RNA

EPHE Banque de Monographies SVT 5miRNP : miRNA protein complex
mL : Milli-litre
MRF : Muscle Regulatory Factors
NBT : Nitro Blue Tetrazolin
NNK : nitrosamine 4-méthylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone
NS : N-terminal Sequence
PBS : Phosphate Buffer Saline
PCR : Polymerase Chain Reaction
PEST : Proline-Glutamate-Sérine-Thréonine
pI : Point isoélectrique
PK : Protéine Kinase
PM : Poids Moléculaire
PMA : Phorbol Myristate Acétate
qsp : Quantité suffisante pour
RISC : RNA Induced Silencing Complex
RNAi : ARN interférence
rpm : Rotation par minute
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Shh : Sonic hedgehog
siRNA : short interfering RNA
SVF : Sérum de Veau Foetal
TEMED : N,N,N’,N’- Tetramethyl Ethylene Diamine
Tm : Melting Temperature
UTR : Untranslated Region 3’
UV : Ultra Violet
WB : Western Blot



















EPHE Banque de Monographies SVT 6





























Une cellule est constamment en train de se renouveler et les molécules qui la composent sont en
perpétuelle dynamique. Le cycle protéique régule le cycle cellulaire de la même façon que le cycle de
la matière régule le cycle de la vie.
Les protéines essentielles au fonctionnement cellulaire sont synthétisées en continu pour fournir un
stock de molécules actives. En parallèle, le processus inverse nommé catabolisme est aussi important.
Dans ce cas, les protéines fournissent des acides aminés pour la synthèse et évitent le déséquilibre
entre protéines synthétisées et protéines détruites.
La dégradation des protéines intracellulaires est un processus essentiel non seulement dans la
physiologie de la cellule mais aussi de l’organisme entier. Au-delà de son rôle dans l’élimination des
polypeptides anormaux et le maintien de l’homéostasie cellulaire, elle confère un caractère
irréversible à certains processus biologiques fondamentaux, comme la progression unidirectionnelle
dans le cycle cellulaire, la différenciation ou l’apoptose. La protéolyse affecte donc des fonctions
importantes de l’organisme tels que l’organogenèse ou la morphogenèse. En raison de son importance
biologique, il est raisonnable de suspecter que des altérations des mécanismes de la protéolyse
intracellulaire puissent avoir des conséquences pathologiques.
La protéolyse est un processus catalytique qui conduit au clivage (hydrolyse) de la liaison peptidique
EPHE Banque de Monographies SVT 7aux extrémités (exopeptidases) ou à l’intérieur (endopeptidases) de la chaîne polypeptidique. Les
protéases sont d’abord des hydrolases. On distingue quatre familles de protéases selon la nature du
groupe fonctionnel le plus important du site catalytique : sérine, cystéine, aspartique ou métallo
protéases. Leurs rôles peuvent être divisés en trois parties : un rôle extracellulaire (digestion des
nutriments, digestion de la matrice extracellulaire…), un rôle intracellulaire (activation d’hormones,
régulation des cycles cellulaires, éliminations des structures cellulaires vieillissantes, non
fonctionnelles ou devenues inutiles…) et un rôle dans les processus pathologiques d’origine
ischémique ou génétique.
En raison de ces différents rôles, des questions importantes se posent alors notamment au sujet de la
régulation (pH, facteurs métalliques, inhibiteurs…) mais aussi au niveau de la rencontre avec la cible
(diffusion, milieu clos, structure spécialisée).
Parmi ces quatre famille de protéases, nous porterons notre attention sur celle des protéases à
cystéine, qui comprend les caspases, les calpaïnes, les papaïnes et les streptopaïnes.
Notre travail se focalisera plus particulièrement sur les calpaïnes, leur importance et leur implication
au niveau des cellules musculaires.


I ) Les calpaïnes :

Ces calpaïnes sont des enzymes cytoplasmiques, non lysosomales, neutres et dépendantes du calcium
(Croall et al, 1994). Quatorze isoformes ont été trouvées à ce jour (Frame et al, 2002). Les plus
représentées des calpaïnes sont la m- et la m-calpaïne ou calpaïne 1 et 2. Ce sont des calpaïnes
ubiquitaires présentes dans tous les tissus animaux. A ces calpaïnes, il faut rajouter diverses formes
moins conventionnelles issues d’un épissage alternatif, ou de l’absence d’une sous unité, ainsi que
des formes spécifiques d’un tissu donné, comme la calpaïne 3 (p94) qui est muscle-spécifique.

Ces protéases sont impliquées dans des évènements majeurs de la cellule (cycle cellulaire, apoptose,
gestion du cytosquelette, régulation des cascades de signalisation) ; l’inhibition complète de
l’expression de la sous-unité régulatrice des formes ubiquitaires est létale (Goll et al, 2003). Elles
clivent souvent les liaisons entre deux domaines d’un substrat provoquant la perte ou l’acquisition de
fonctions plutôt qu’une destruction du substrat. Les calpaïnes changeraient donc les propriétés de leur
substrat par un ciblage puis un clivage spécifique.

A ) Structure des calpaïnes :

1 ) Calpaïnes ubiquitaires :

Les calpaïnes sont des hétérodimères constitués de deux sous-unités codées par deux gènes différents,
une sous-unité catalytique de 80 kDa et une sous-unité régulatrice de 28 kDa. Bien que les calpaïnes
1 et 2 soient les produits de gènes différents, respectivement localisés sur les chromosomes 11 et 1,
EPHE Banque de Monographies SVT 8celles-ci présentent au sein d’une même espèce 55 à 65% d’homologie.

La sous-unité de 80 kDa se compose de quatre domaines I à IV, et la sous-unité de 28 kDa comporte
quant à elle, deux domaines V et VI.

Le domaine I correspond au domaine N-terminal des molécules et est organisé en hélice. A ce jour,
aucune fonction particulière pour ce domaine n’a encore été démontrée.

Le domaine II est le domaine catalytique, il possède la clé active. Celui-ci est divisé en deux sous-
domaines appelés IIa et IIb. Le site actif de la molécule est composé d’une triade de résidus
caractéristiques des protéases à cystéine, renfermant donc une cystéine localisée en position 115 et
105, une histidine en position 272 et 262, et un résidu asparagine en position 296 et 286,
respectivement pour les calpaïnes 1 et 2. Une récente étude du domaine II par cristallographie a
montré que ce domaine était capable de lier un atome de calcium et que cette liaison entraîne un
changement conformationnel du domaine II. Il semblerait aussi que ce changement rapproche dans
l’espace les sous-domaines IIa et IIb, mettant à proximité les résidus de la triade, afin de donner un
complexe catalytiquement fonctionnel. Cependant il est fort probable que ce soit la combinaison de
changements conformationnels dus au calcium sur la protéine entière qui conduise à la formation de
la clé active (Moldoveanu et al, 2002).

Le domaine III est un domaine possédant deux sites potentiels de fixation au calcium de type EF-
hand. Il est aussi impliqué dans la fixation aux phospholipides. Ces derniers pourraient réguler leur
activité par liaison aux calpaïnes (Tompa et al, 2001).

Le domaine IV possède une forte homologie avec la calmoduline. L’étude cristallographique de ce
domaine a révélé la présence de cinq sites potentiels de fixation au calcium de type EF-hand. Les
domaines penta-EF-hand sont connus pour se dimériser entre eux, ce qui semble confirmé dans ce
cas, car le domaine IV lie la petite sous-unité régulatrice de 28 kDa qui possède également un penta-
EF-hand (Blanchard et al, 1997 ; Lin et al, 1997).

Le domaine V est le NH2 terminal de la sous-unité régulatrice. Ce domaine est composé
essentiellement de résidus glycine, conférant à ce domaine une forte hydrophobicité. Lors de
l’activation des calpaïnes ce domaine est clivé par la sous-unité catalytique de 80 kDa, et est dissocié
du complexe actif.

Le domaine VI est un domaine possédant cinq sites de fixation au calcium type EF-hand qui lui
permettent de se fixer au IV (Blanchard et al, 1997 ; Strobl et al, 2000). Après autolyse de
la protéase, au moment de l’activation, celui-ci reste lié à la sous-unité catalytique sous une forme de
18 kDa au contact du domaine IV (Mc Celland et al, 1989).

EPHE Banque de Monographies SVT 92 ) Calpaïne 3 ou p94 :

La calpaïne 3 est une protéase de 94 kDa, décrite comme étant spécifique du muscle squelettique. Elle
possède les quatre domaines des calpaïnes ubiquitaires détaillés dans le paragraphe précédent mais
pas la sous-unité régulatrice de 30 kDa. Trois insertions spécifiques la différencient des calpaïnes
ubiquitaires. Il y a une insertion en N-terminal, appelé NS, qui correspond aux acides aminés 1 à 30
de la molécule, une autre située dans le domaine II, appelé IS1, allant de l’acide aminé 268 à 315, et
une dernière localisée en fin de domaine III, à proximité du domaine IV, nommé IS2, couvrant une
ème èmerégion du 592 au 638 acide aminé. Les rôles de ces insertions ne sont pas encore complètement
élucidés, mais IS1 jouerait le rôle d’un propeptide (Diaz et al, 2004) et IS2, qui contient une séquence
basique (PVKKKKNKP), pourrait permettre à la protéase d’avoir une localisation nucléaire
(Sorimachi et al, 1989). Toutefois il semblerait que ces insertions confèrent à la p94 une forte
instabilité (Sorimachi et al, 1993).

B ) Régulations des calpaïnes :

Les calpaïnes sont synthétisées sous forme de pro-enzyme. L’activation de la calpaïne proprement
dite, débute par une autolyse de l’enzyme qui modifie la partie N-terminale des deux sous-unités
(Elce et al, 1997). L’autolyse libère notamment des formes intermédiaires mais cependant actives de
la sous-unité catalytique (78 et 76 kDa).

1 ) Par le calcium :

In vitro, la calpaïne 1 requiert des concentrations de calcium allant de 5 à 50 mM pour être activée,
alors que la 2 nécessite quant à elle de 250 à 1000 mM de calcium (Ohno et al, 1984). D’où
leur dénomination respective, micro- et milli-calpaïne.
In vivo, une concentration de calcium de l’ordre du millimolaire n’est pas envisageable, elle serait
plutôt de l’ordre du nanomolaire.
En absence de calcium, les sous-domaines IIa et IIb sont séparés par des contraintes structurales
imposées par le domaine d’interaction. Les changements de conformation induits par le calcium
libèrent le site catalytique. La fixation du calcium aux domaines III, IV et VI libère le domaine I du
IV et le domaine II du III et permet ainsi l’activation de la sous-unité catalytique. Le domaine V de la
sous-unité régulatrice de 30 kDa est clivé après cette activation et seul le domaine VI reste accroché à
la sous-unité de 80 kDa. Puis la fixation de deux molécules de calcium au domaine catalytique
entraîne le réarrangement de la clé du site actif (Moldveanu et al, 2002).
La présence de phospholipides (PiP2 par exemple) à proximité des calpaïnes permet d’abaisser la
concentration en calcium nécessaire à l’activation des protéases (Suzuki et al, 1992).

2 ) Par la calpastatine, inhibiteur des calpaïnes :

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