Relation entre le métabolisme central carboné et la réplication de l'ADN chez la bactérie Bacillus subtilis

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Niveau: Supérieur, Master, Bac+5
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Bérengère DALMAIS-LENAERS Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Relation entre le métabolisme central carboné et la réplication de l'ADN chez la bactérie Bacillus subtilis Soutenu le 17 décembre 2007 devant le jury suivant : A. Paldi - Président de jury F. Renaud-Païtra -Tuteur pédagogique L. Jannière -Tuteur scientifique D. Le Coq - Examinateur J.P. Raffin - Examinateur D. Dory - Examinateur Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique de l'EPHE UMR 8159- 45, avenue des Etats-Unis- 78035 Versailles cedex Tutrice pédagogique : F. Renaud-Païtra Laboratoire de Génétique Microbienne INRA- Domaine de Vilvert- 78352 jouy-en-josas cedex Responsable scientifique : L. Jannière Liste des Abréviations EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • arnt acide

  • adn de la protéine gal4

  • milieux nutritifs

  • temps de génération

  • réplication de l'adn

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Publié le 01 décembre 2007
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE  Présenté par  Bérengère DALMAIS-LENAERS  Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes  Relation entre le métabolisme central carboné et la réplication de l’ADN chez la bactérieBacillus subtilis   Soutenu le 17 décembre 2007 devant le jury suivant :  
A.   Paldi - Président de jury F. Renaud-Païtra -Tuteur pédagogique L. Jannière -Tuteur scientifique D. Le Coq - Examinateur J.P. Raffin - Examinateur D. Dory - Examinateur  
   Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique de l'EPHE UMR 8159- 45, avenue des Etats-Unis- 78035 Versailles cedex Tutrice pédagogique : F. Renaud-Païtra flore.renaud@uvsq.fr  Laboratoire de Génétique Microbienne INRA- Domaine de Vilvert- 78352 jouy-en-josas cedex Responsable scientifique : L. Jannière laurent.janniere@jouy.inra.fr  Liste des Abréviations
aa AckA AD-Gal4 ADN ADP AMP ARN ARNm ARNr ARNt ATP BD-Gal4 BPG CASA CcpN CO2 Ct (d)NTP DO DO -L DO -LU  DO –LUA DO –LUH DO -U DO600nm Eno F6P FBP G G3P G6P Gal4 GAPDH GTP HTH ILV kD LB Mb MCC MM mM NAD NADH NADPH NDP O2 Ori PCR
  
acides aminés acétate kinase Domaine d’activation de la protéine Gal4 acide désoxyribonucléique adénine di phosphate adénine monophosphate acides ribonucléiques acides ribonucléiques messagers acides ribonucléiques ribosomaux acides ribonucléiques de transfert adénosine tri phosphate Domaine de liaison à l’ADN de la protéine Gal4 1,3 di-phospho glycérate casaminoacides Protéine de contrôle catabolique de la néoglucogenèse dioxyde de carbone nombre de cycle d’amplification en PCRq (désoxy) ribonucléotide tri phosphate Milieu contrôlé Drop-out Milieu contrôlé Drop-out sans Leucine Milieu contrôlé Drop-out sans Leucine et Uracile Milieu contrôlé Drop-out sans Leucine, Uracile et Adénine Milieu contrôlé Drop-out sans Leucine, Uracile et Histidine Milieu contrôlé Drop-out sans Uracile Densité optique à 600 nm enolase fructose-6-phosphate fructose bi-phosphate Temps de génération (en minutes) 3-phospho glycérate glucose-6-phosphate protéine de la levure ayant une fonction d’activateur transcriptionnel glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase guanosine tri phosphate motif helix-turn-helix acides aminés isoleucine, leucine, valine unité : kilo dalton milieu de culture riche Luria Bertani unité : mégabases métabolisme central carboné milieu minimum unité : millimolaire nicotinamide adénine dinucléotide (forme oxydée) nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite) nicotinamide adénine dinucléotide phosphate ribonucléotide di phosphate dioxygène origine réaction de polymérisation en chaîne (polymerisation chain
PCRq PdhABCD PEP Pfam Pfk PG pGAD pGBDU Pgk Pgm PHP (p)ppGpp PTS PykA RIDA RNR Rtp sRNA SSB TCS Ter Tpi Tr Ts uPA uPAR        
 
reaction) PCR quantitative en temps réel pyruvate déhydrogénase sous-unité A, B, C ou D phosphoenolpyruvate Base de donnée de familles protéiques-http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ phosphofructokinase phosphoglycérate plasmide possédant le domaine d’activation de Gal4 plasmide possédant le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 phospho glycérate kinase phosphoglycérate mutase polymérase et histidinol phosphatase guanosine tetra (ou penta) phosphate phosphotransferase system pyruvate kinase regulatory inactivation of DnaA chezE. coli ribonucléotide réductase protéine de terminaison de la réplication petits ARN ribonucléiques (small ribonucleic acid) single strand binding- protéine se liant à l’ADN simple brin système à 2 composants (two component system) terminus triose phosphate isomérase thermorésistant thermosensible plasminogène de type urokinase récepteur de l’activateur plasminogène de type urokinase        
        Résumé
     Les bactéries doivent faire face au cours de leur croissance et de leur évolution à des milieux nutritifs dont la richesse varie de façon importante. Afin de survivre et de se multiplier dans ces différents milieux, elles ont développé de nombreux mécanismes allant de processus extrêmes tels que l’entrée en dormance (sporulation) à une grande souplesse d’adaptation de leur métabolisme en modulant les fonctions cellulaires essentielles telles que la transcription, la traduction et/ou la réplication de l’ADN. Dans ce travail, nous nous sommes particulièrement intéressés à la modulation de la réplication de l’ADN lors de l’adaptation du cycle cellulaire des bactéries aux contraintes nutritionnelles.  Afin de coordonner le temps nécessaire à la réplication de l’ADN au temps de génération induit par le milieu, les bactéries peuvent modifier la fréquence d’initiation de la réplication ou la durée de synthèse du chromosome. Dans des conditions de croissance rapide, il a été observé que lorsque le temps de génération diminue, la fréquence d’initiation de la réplication augmente tandis que le temps de synthèse du chromosome reste constant. Dans des conditions de croissance lente, différentes études réalisées chezEscherichia coli à Gram négatif) indiquent que la durée de la phase (bactérie d’élongation du chromosome pourrait être corrélée avec le temps de génération. Nous avons recherché si une telle coordination avait lieu chez les bactéries à Gram positif et quelles étaient les protéines impliquées dans ce processus. Pour cela, nous avons centré nos recherches sur l’organisme modèleBacillus subtilis.  Dans un premier temps, nous avons mis en évidence l’existence du lien entre le milieu nutritif et la réplication de l’ADN de deux manières : (1) des mesures de la fréquence d’initiation effectuées par PCR quantitative en temps réel et du temps de génération indiquent que, comme chezE. coli, la richesse du milieu nutritif module les phases d’initiation et/ou d’élongation de la réplication, selon la vitesse de croissance, et (2) des souches altérées dans leur fonction réplicative (par des mutations thermosensibles) peuvent être ‘sauvées’ par la composition du milieu nutritif dans lequel elles se trouvent.  Dans un second temps, par une approche génétique, nous avons identifié cinq protéines de la partie basse de la glycolyse (GapA, Pgk, Pgm, Eno et PykA) et trois protéines essentielles de réplication (l’hélicase DnaC, l’ADN polymérase DnaE et la primase DnaG) qui semblent jouer un rôle spécifique dans le lien entre le métabolisme central carboné et la réplication de l’ADN. Enfin, par la technique du double hybride, nous avons identifié des interactions entre des protéines du métabolisme carboné (PdhB, CcpN, MetC) et des protéines de la réplication (DnaC, DnaG et DnaA). Ceci nous permet d’envisager des pistes de recherches sur d’éventuels moyens de communication entre ces deux grands domaines cellulaires. Parallèlement, nos recherches nous ont permis de découvrir l’existence d’interactions protéiques entre la polymérase DnaE et deux protéines essentielles du réplisome (l’hélicase DnaC et la primase DnaG) qui confortent le rôle majeur de la polymérase DnaE au sein du réplisome, proposé précédemment par notre laboratoire.  
INTRODUCTION......................................................................................................................... 8 1 BACILLUS SUBTILIS.............................................................................................................. 8 1.1 Classification microbienne................................................................................................ 8 1.2 Caractéristiques de B. subtilis........................................................................................... 9 1.3 Intérêt industriel............................................................................................................ 10 2      B.SUBTILIS ET SON IVORNETENEMNN..................................................................................... 10 2.1 Adaptation lors de changements brutaux............................................................................ 11 2.1.1 Réponse au stress général........................................................................................................................................ 11 2.1.2 Réponse au stress thermique.................................................................................................................................. 12
2.1.3 Réponse au stress nutritif........................................................................................................................................ 13 2.1.3.1     CodY........................................................................................................................................................................ 13 2.1.3.2 La réponse stringente.......................................................................................................................................... 14 2.1.4 Réponse à des dommages sur l’ADN.................................................................................................................... 15 2.2 Adaptation au sein d’un environnement équilibré................................................................. 16 2.2.1 Modifications globales............................................................................................................................................ 16 2.2.1.1 Temps de génération........................................................................................................................................... 16 2.2.1.2 Taille des cellules................................................................................................................................................ 17 2.2.2 Modulation du cycle cellulaire.............................................................................................................................. 17 2.2.3 Modulation de la composition cellulaire........................................................................................................... 18 2.2.3.1 L’appareil transcriptionnel............................................................................................................................... 19 2.2.3.2 L’appareil traductionnel.................................................................................................................................... 19 2.2.3.3 L’appareil de réplication.................................................................................................................................... 20 2.3 Perception et transfert des signaux environnementaux chez B. subtilis..................................... 20 2.3.1 Transfert de signal par phosphorylation : phosphorylation, systèmes à deux composants et « phosphorelay » 20 2.3.1.1 Les enzymes impliquées dans le transfert de phosphate sur d’autres protéines................................ 21 2.3.1.2 Les systèmes à deux composants (TCS)........................................................................................................ 22 2.3.1.3 Les « phosphorelays »........................................................................................................................................ 22 2.3.2 Les petits ARN (sRNA)............................................................................................................................................. 23 2.3.3 Les interactions protéiques..................................................................................................................................... 24 3 MILIEU NUTRITIF ET NÉRICPLIOAT DE L’ADNCHEZ B.SUBTILIS.................................................. 25 3.1 Milieu nutritif et métabolisme central carboné (MCC).......................................................... 25 3.1.1 Milieu nutritif deB. subtilis................................................................................................................................... 25 3.1.1.1 Les composants du milieu essentiels àB. subtilis..................................................................................... 26 3.1.1.2 Les nutriments « préférentiels »...................................................................................................................... 27 3.1.2 Le métabolisme central carboné (MCC)............................................................................................................... 27 3.1.2.1 Glycolyse et Néoglucogenèse.......................................................................................................................... 27 3.1.2.2 La voie des Pentoses Phosphate...................................................................................................................... 33 3.1.2.3 Le cycle de Krebs (ou cycle des acides tricarboxyliques-TCA).............................................................. 33 3.1.2.4 Complexe et enzymes intermédiaires............................................................................................................. 34 3.1.3 Régulation du MCC en fonction du milieu nutritif......................................................................................... 36 3.1.3.1 Régulation du flux glycolytique.................................................................................................................... 36 3.1.3.2 Régulation du flux néoglucogénique............................................................................................................ 38 3.1.3.3 Régulation du cycle de Krebs........................................................................................................................... 39 3.1.3.4 La voie excédentaire............................................................................................................................................ 39 3.2 Réplication de l’ADN...................................................................................................... 40 3.2.1 La réplication de l’ADN............................................................................................................................................ 40 3.2.1.1     Généralités............................................................................................................................................................. 40 3.2.1.2 Etapes de la réplication...................................................................................................................................... 41 3.2.1.3 Description du réplisome.................................................................................................................................. 42 3.2.2 Régulation de la réplication de l’ADN................................................................................................................. 47 3.2.2.1 Régulation de la phase d’initiation................................................................................................................ 47 3.2.2.2 Régulation de la phase d’élongation............................................................................................................. 49 3.3 Métabolisme carboné et réplication de l’ADN : projet de recherche......................................... 51 RÉSULTATS................................................................................ 1 EXISTENCE DUNE RELATION ENTRE LEMCCET LA ÉRLPCIATION DE L’ADNCHEZ B.SUBTILIS SIGNET NON DÉFINI. 1.1 Des modifications du MCC par des sources carbonées restaurent la croissance de mutants de réplication Signet non défini. 1.1.1 Validation des milieux de culture..........................................................................Signet non défini. 1.1.2 Test de survie des souches mutantes selon le milieu nutritif.........................Signet non défini. 1.2 Le MCC module les propriétés de réplication..................................Signet non défini. 1.2.1 Modification nutritionnelle : des modifications nutritionnelles modulent les propriétés de réplicationSignet non défini. 1.2.1.1 Mise au point de la technique de PCR temps réel........................................Signet non défini. 1.2.1.1.1 Optimisation de la PCR en temps réel.......................................................Signet non défini. 1.2.1.1.2 Mise au point technique................................................................................Signet non défini. 1.2.1.1.3 Reproductibilité de la technique................................................................Signet non défini. 1.2.1.2 Choix des sources de carbone............................................................................Signet non défini. 1.2.1.3 Echelonnement des temps de générations......................................................Signet non défini. 1.2.1.4 Mesure de la fréquence d’initiation et de la vitesse moyenne de synthèse de l’ADN dans ces différents milieuxSignet non défini. 1.2.2 Modification génétique : Une mutation dans un des gènes du MCC peut moduler les propriétés de