STRASBOURG I FRANCE

Jean - Luc Imler

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I- FRANCE 2007 THESE Présentée à la FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE En vue de l'obtention du titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Domaine: Biologie Cellulaire et Moléculaire des Plantes par Maghsoud PAZHOUHANDEH The Mechanism of Action of Polerovirus P0 in RNA Silencing Suppression Soutenu le 6 Septembre 2007 devant la Commission d'Examen: Dr. Jean-Luc IMLER Rapporteur Interne Dr. Thierry CANDRESSE Rapporteur Externe Dr. Stéphane GENIN Rapporteur Externe Dr. Olivier VOINNET Examinateur Dr. Pascal GENSCHIK Examinateur Dr. Kenneth RICHARDS Examinateur Invité Dr. Véronique ZIEGLER-GRAFF Directrice de Thèse Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (CNRS-IBMP UPR 2357)

• mécanisme d'action de la pr otéine


• arabidopsis skp1-like


• post-transcriptional


• ?????? ?? ????


• protéine


• protéine essentielle du complexe risc


• ?? ??????


• complexes scf


• ????? ??

Sujets

• Richards
• Silencing
• Ziegler
• Candresse
• First on the Moon

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Nombre de lectures: 67
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
STRASBOURG I- FRANCE
2007

THESE


Présentée à la

FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE

En vue de l'obtention du titre de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR

Domaine: Biologie Cellulaire et Moléculaire des Plantes

par

Maghsoud PAZHOUHANDEH


The Mechanism of Action of Polerovirus P0 in
RNA Silencing Suppression


Soutenu le 6 Septembre 2007 devant la Commission d'Examen:

Dr. Jean-Luc IMLER Rapporteur Interne
Dr. Thierry CANDRESSE Externe
Dr. Stéphane GENIN
Dr. Olivier VOINNET Examinateur
Dr. Pascal GENSCHIK
Dr. Kenneth RICHARDS Examinateur Invité
Dr. Véronique ZIEGLER-GRAFF Directrice de Thèse

Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (CNRS-IBMP UPR 2357)





Abstract

The poleroviruses are an agronomically important genus of plant viruses which can infect a
wide range of hosts. Their genome is a single-stranded plus-sense RNA. The 5’-terminal ORF
encodes the 29 kDa protein P0, a strong suppressor of Post-Transcriptional Gene Silencing
(PTGS), an important antiviral defense system in plants. I have investigated the mechanism of
action of P0 in suppression of RNA silencing. A yeast two-hybrid screen of an Arabidopsis
thaliana cDNA library identified two closely related Arabidopsis SKP1-like proteins (ASK) as
a cellular partner for P0. ASK is a component of the SCF class of E3 ubiquitin ligases involved
in the protein ubiquitination and degradation pathway. A conserved F-box like-motif was
identified near the N-terminus of P0, suggesting that P0 is a viral-coded F-box protein. F-box
proteins are the components of the SCF complex that specifically recognize target proteins. The
targets are then usually polyubiquitinated as a marker for proteolysis by the 26S proteasome. P0
mutated in the F-box motif did not interact with ASK and conferred low pathogenicity to the
virus in plants. Nicotiana benthamiana in which SKP1 levels were knocked down by
virusinduced gene silencing were resistant to polerovirus infection. The F-box motif was also
essential for silencing suppression activity of P0 in an agroinfiltration assay. Transgenic
Arabidopsis expressing P0 under control of an inducible promoter showed abnormal
phenotypes. A subset of miRNAs in the induced P0 plants accumulated less abundantly than in
non-induced plants and miRNA-targeted endogenous transcripts were upregulated, indicating
that P0 interferes with the miRNA pathway. P0 also suppressed IR-PTGS at a step downstream
of Dicer (DCL) activity, suggesting that ARGONAUTE1 (AGO1), the slicer protein in the
RNA-induced silencing complex (RISC) might be the target of P0. Indeed, P0 specifically
provoked AGO1 degradation in both transient expression experiments and in crossed
P0FlagAGO1 Arabidopsis. A physical interaction between P0 and AGO1 was demonstrated both
in vitro and in planta, favoring the hypothesis that AGO1 is the direct target of P0. Our data
support a model in which P0 acts as an F-box protein, recruiting the post-translational
modification system to overcome the post-transcriptional gene silencing system. In this model
P0P0 interacts with SKP to constitute a SCF complex which presumably addresses AGO1 for
ubiquitination and degradation by 26S proteasome. This would be the first example of a
suppressor of RNA silencing that acts in an SCF complex to promote degradation of an
essential component of the silencing pathway, thereby, inhibiting the plant antiviral defense.
In Persian (Farsi)

RNA Silencing زا ﯽﮔﺪﻧرادزﺎﺑ رد Polerovirus ﻪﺑ ﻖﻠﻌﺘﻣ P0 ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻞﻤﻋ ﻢﺴﻴﻧﺎﮑﻣ


مﻮﻧژ . ﺪﻨﻨﮐ ﯽﻣ ﻩدﻮﻟﺁ ار ﯼدﺎﺼﺘﻗا ﺖﻴﻤها ﯼاراد نﺎهﺎﻴﮔ زا ﯽﻌﻴﺳو ﻪﻨﻣاد Polerovirus ﺲﻨﺟ ﻪﺑ ﻖﻠﻌﺘﻣ ﯼﺎﻬﺳوﺮﻳو : ﻩﺪﻴﮑﭼ
ﺪﻨﮑﻴﻣ ﺪﮐ ار 29kDa نزو ﻪﺑ P0 مﺎﻨﺑ ﯽﻨﻴﺌﺗوﺮﭘ نﺁ 5' ﯼﺎﻬﺘﻧا ORF و ﻩﺪﺷ ﻞﻴﮑﺸﺗ ﺖﺒﺜﻣ ﯼا ﻪﺘﺷر ﮏﺗ RNA ﮏﻳ زا ﺎﻬﻧﺁ
ﻩﺪﻬﻋ ﻪﺑ نﺎهﺎﻴﮔ رد ار ﺎﻬﺳوﺮﻳو ﺮﺑاﺮﺑ رد ﯽﻋﺎﻓد ﺶﻘﻧ ﺪﻨﻳاﺮﻓ ﻦﻳا .ﺖﺳا Gene Silencing ﺪﻨﻳ اﺮﻓ زا ﯼﻮﻗ ﻩﺪﻧرادزﺎﺑ ﮏﻳ ﻪﮐ
ﯽﻟﻮﻠﺳ ﮏﻳﺮﺷ ﯼﻮﺠﺘﺴﺟ شور زا ، نﺎﺑﺰﻴﻣ ﯽﻋﺎﻓد ﻢﺘﺴﻴﺳ ﻦﻳا زا ﯽﮔﺪﻧرادزﺎﺑ رد P0 ﻞﻤﻋ ﻢﺴﻧﺎﮑﻣ ﻪﺑ ندﺮﺑ ﯽﭘ ﯼاﺮﺑ .د ر اد
ﻢه ﻪﺑﺎﺸﻣ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ود و ﺪﺷ ﻩدﺎ ﻔﺘﺳا ،Arabidopsis thaliana ،لﺪﻣ ﻩﺎﻴﮔ cDNA ﮏﻧﺎﺑ رد ﺮﻤﺨﻣ ﺪﻳﺮﺒﻴه ﻞﺑود ﮏﻤﮑﺑ
ﯽﺑﻮ ﻳ E3 ﯼﺎ gﻬﻤﻳﺰﻧﺁ ﻪ ﻋﻮﻤﺠﻣ زا SCF ﭗ ﻴﺗ زا ﯽ ﺋﺰﺟ ASK .ﺪ ﻳدﺮﮔ ﻒ ﺸﮐ (Arabidopsis SKP1-like) ASK مﺎ gﻨﺑ
ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ F-box . ﺪﻧوﺮﻴﻣ رﺎﮑﺑ موزﺎﺌﺗوﺮﭘ ﻂﺳﻮﺗ ﺎﻬﻨﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻪﻳﺰﺠﺗ و ندﺮﮐ ﻪﻨﻴﺘﻳﻮﮐ ﯽﺑﻮﻳ ﻢﺘﺴﻴﺳ رد ﻪﮐ ﺖﺳا زﺎﮕﻴﻟ ﻦﻴﺘﻳﻮﮐ
ﻩﺪﻬﻋ ﻪﺑ ندﺮﮐ ﻪﻨﻴﺘﻳ ﻮﮐ ﯽﺑﻮﻳ ﯼاﺮﺑ ار فﺪه ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﯽﻳﺎﺳﺎﻨﺷ ﺶﻘﻧ و ﺪﺒﺴﭼ ﯽﻣ ASK ﻪﺑ ﻪﮐ ﺖﺳا SCFزا ﯼﺮﮕﻳد ءﺰﺟ
ﻦﻳﺪ ﻨﭼ P0 ﯽﻟاﻮ ﺗ ﯽ ﺳرﺮﺑ .ﺪﻨﺘ ﺴه دﻮ ﺧ ﻪ ﻨﻴﻣ ﺁ ﯼﺎ ﻬﺘﻧا رد ﺖ ﺑﺎﺛ ﻪ ﻨﻴﻣﺁ ﺪﻴ ﺳا ﯽﻟاﻮ ﺗ ﮏ ﻳ ﯼاراد ﺎ ﻬﻨﻴﺌﺗوﺮﭘ F-box .دراد
F-box ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﮏﻳ ﺪﻧاﻮﺘﻴﻣ P0 ﻪﮑﻨﻳا ﺮﮕﻧﺎﺸﻧ ﺖﺳا ﻩﺪﺷ ﺖﻇﺎﻔﺣ ﺎه P0 مﺎﻤﺗ رد ﯽﻟاﻮﺗ ﻦﻴﻨﭼ ﻪﮐ داد نﺎﺸﻧ Polerovirus
ﺮﻴﮕﻤﺸﭼ ﺶهﺎﮐ ﺚﻋﺎﺑ سوﺮﻳو رد نﻮﻴﺳﺎﺗﻮﻣ ﻦﻴﻨﭼ و ﺪﻨﮐ ﻞﻣﺎﻌﺗ ASK ﺎﺑ ﺖﺴﻧاﻮﺘﻧ F-box ﺖﺑﺎﺛ ﯽﻟاﻮﺗ رد ﺖﻧﺎﺗﻮﻣ P0 .ﺪﺷﺎﺑ
Virus Induced ﻂﺳﻮﺗ ﺎﻬﻧﺁ SKP نژ ﻪﮐ Nicotiana benthamiana نﺎهﺎﻴﮔ . ﺪﻳدﺮﮔ ﻩﺎﻴﮔ رد سوﺮﻳو ﯽﻳاﺰﻳرﺎﻤﻴﺑ
ﯽﻟاﻮﺗ ﻪﮐ داد نﺎﺸﻧ ﺮﮕﻳد تﺎﺸﻳﺎﻣزﺁ .ﺪﻧدﻮﺑ موﺎﻘﻣ ﺎهPolerovirus ﻂﺳﻮﺗ ﯽ ﮔدﻮﻟﺁ ﻪﺑ دﻮﺑ ﻩﺪﺷ شﻮﻣﺎﺧ Gene Silencing
ﻩﺪﻨﻨﮐ نﺎﻴﺑ ﮏﻴﻧﮋﺴﻧاﺮﺗ Arabidopsis نﺎهﺎﻴﮔ .ﺖﺳا ﯼروﺮﺿ RNA Silencing زا ﯽﮔﺪﻧرادزﺎﺑ ﯼاﺮﺑ ﺎهP0 رد F-box
ﻩﺪﺷ ءﺎﻘﻟا P0 نﺎهﺎﻴﮔ رد ﺎهmiRNA زا ﯼداﺪﻌﺗ ﻊﻤﺠﺗ .ﺪﻧداد نﺎﺸﻧ ﯽﻌﻴﺒﻃﺮﻴﻏ ﭗﻴﺗﻮﻨﻓ ءﺎﻘﻟا ﻞﺑﺎﻗ رﻮﺗﻮﻣوﺮﭘ لﺮﺘﻨﮐ ﺖﺤﺗ P0
ﻊﻤﺠﺗ ﻩﺪﺷ ءﺎﻘﻟا نﺎهﺎﻴﮔ رد ﺪﻧﻮﺸﻴﻣ لﺮﺘﻨﮐ ﺎه miRNA ﻂﺳﻮﺗ ﻪﮐ ﯽﻳﺎهmRNA زا ﯼداﺪﻌﺗ و دﻮﺑ ﺮﺘﻤﮐ ﻩﺪﺸﻧ ءﺎﻘﻟا ﻪﺑ ﺖﺒﺴﻧ
ﻦﻴﻨﭽﻤه P0 . ﺪﻨﮑﻴﻣ ﻞﺘﺨﻣ ﻩﺎﻴﮔ رد ﻢه ار ﺎهmiRNA ﺮﻴﺴﻣ ،siRNA ﺮﻴﺴﻣ ﺮﺑ ﻩوﻼﻋ P0 ﻪﮑﻨﻳا زا ﯽﮐﺎﺣ ﺪﻨﺘﻓﺎﻳ ﯼﺮﻴﮕﻤﺸﭼ
ﺪﻳﺎﻤﻧ ﻞﺘﺨﻣ Dicer ﻞﻤﻋ زا ﺮﺘﻨﻴﻳﺎﭘ ﯼا ﻪﻠﺣﺮﻣ رد ﻢه ار Inverted-Repeat ر ﺎﺘﺧﺎﺳ زا ﯽﺷﺎﻧ Gene Silencing ﺖﺴﻧاﻮﺗ
RNA Silencing ﻢﺘﺴﻴﺳ رد (RNA-Induced Silencing Complex) RISC ﺲﮑﻠﭙﻤﮐ زا ﯽﻨﻴﺌﺗوﺮﭘ ﻪﮑﻨﻳا ﺮﮕﻧﺎﺸﻧ
ARGONAUTE1 (AGO1) ﺎﺑ P0 نﺎﻣﺰﻤه نﺎﻴﺑ زا ﻩدﺎﻔﺘﺳا ﺎﺑ ﯼﺪﻌﺑ تﺎﺸﻳﺎﻣزﺁ . دﺮﻴﮕﻴﻣ راﺮﻗ فﺪه درﻮﻣ P0 ﻂﺳﻮﺗ
و P0 ﻦﻴﺑ ﻢﻴﻘﺘﺴﻣ ﻞﻣﺎﻌﺗ ،ﻪﻣادا رد .ﺪﻳدﺮﮔ ﻪﻳﺰﺠﺗ P0 رﻮﻀﺣ رد ARGONAUTE1 ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ و دﺮﮐ ﺖﺑﺎﺛ ار ﻪﻴﺿﺮﻓ ﻦﻳا
ﻞﻤﻋ ﻢﺴﻴﻧﺎﮑﻣ ﯼاﺮﺑ ﯽﻟﺪﻣ ﻪﺋارا ﻪﺑ ﯽﻬﺘﻨﻣ ﺞﻳﺎﺘﻧ ،عﻮﻤﺠﻣ رد .ﺪﻳدﺮﮔ ﺖﺑﺎﺛ in planta و in vitro ﯼﺎهﺪﺘﻣ ﻂﺳﻮﺗ AGO1
ﮏ ﻳ ASK ﺎ ﺑ ﻞ ﻣﺎﻌﺗ ﺎ ﺑ و دﻮ ﺸﻴﻣ نﺎ gﻴﺑ ﻩﺎ ﻴﮔ رد سوﺮ ﻳو ﻂ ﺳﻮﺗ ﻪ ﮐ ﺖ ﺳا F-box ﻦﻴﺌﺗوﺮ ﭘ ﮏ ﻳ P0 لﺪ ﻣ ﻦ ﻳا رد .ﺪ ﺷ P0
P0 ﻻﺎﻤﺘﺣا ﺖﺳا Gene Silencing ﺪﻨﻳاﺮﻓ رد ﯼروﺮﺿ ﻮﻀﻋ ﮏﻳ ﻪﮐ ار AGO1 ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ و ﺪهﺪﻴﻣ ﻞﻴﮑﺸﺗ SCF ﺲﮑﻠﭙﻤﮐ
ﻪﮐ ﺖﺳا Gene Silencing زا ﻩﺪﻧرادزﺎﺑ ﻦﻴﺌﺗوﺮﭘ ﮏﻳ زا شراﺰﮔ ﻦﻴﻟوا ﻦﻳا .ﺪﻳﺎﻤﻧ ﯽﻣ ﻪﻳﺰﺠﺗ ندﺮﮐ ﻪﻨﻴﺘﻳﻮﮐ ﯽﺑﻮﻳ ﻖﻳﺮﻃ زا
ﺐﻴﺗﺮﺗ ﻦﻳﺪﺑ و دﻮﺸﻴﻣ Gene Silencing ﻢﺘﺴﻴﺳ رد ﯼروﺮﺿ ﯼﻮﻀﻋ نﺪﺷ ﻪﻳﺰﺠﺗ ﺚﻋﺎﺑ و ﺪﻨﮑﻴﻣ ﻞﻤﻋ SCF ﺲﮑ ﻠﭙﻤﮐ رد
.ﺪﻳﺎﻤﻨﻴﻣ ﻢه ا ﺮﻓ ﯽﺳوﺮﻳو ﯽﮔدﻮﻟﺁ ﯼاﺮﺑ ار ﻪﻨﻴﻣز و ﻪﺘﺴﮑﺷ ار نﺎﺑﺰﻴﻣ عﺎﻓد

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Etude du Mode d’action de la Protéine P0 des Polerovirus dans la
suppression du RNA Silencing

Résumé: Les polerovirus appartiennent à une famille de phytovirus (Luteoviridae)
capables d’infecter de nombreuses plantes d’intérêt agronomique. Leur génome est composé
d'un RNA simple brin de polarité positive dont l'ORF, situé à l’extrémité 5’, code pour la
protéine P0 de 29 kDa, un suppresseur fort de Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS).
Ce phénomène d’extinction de gènes est un moyen de défense antiviral chez les plantes.
Afin d’étudier le mécanisme d'action de la protéine P0, nous avons criblé une banque cDNA
d’Arabidopsis thaliana en système double hybride de levure. Deux protéines de la famille
des protéines SKP1-like d'Arabidopsis (ASK) ont été identifiées comme partenaires
cellulaires de la protéine P0. Les protéines ASK font partie des complexes SCF, un type
d’E3 ubiquitine ligases impliquées dans la voie d'ubiquitination et de dégradation par le
protéasome 26S. Ces complexes renferment également une protéine à F-box qui se lie à la
protéine ASK par son domaine F-box et dont le rôle est la reconnaissance spécifique des
protéines à dégrader. Un motif F-box a été identifié dans la partie N-terminale de la protéine
P0. Une mutation ponctuelle dans ce motif entraîne la perte d’interaction avec les protéines
ASK ainsi que la perte d'activité de suppression de silencing de la protéine P0. Introduite
dans le génome viral, cette mutation confère une baisse importante de la pathogénicité du
virus. Par ailleurs, des plantes de Nicotiana benthamiana, dans lesquelles l’expression du
gène SKP1 a été diminuée par la technique du Gene Silencing induite par un virus (VIGS),
se sont avérées résistantes à l'infection par les polerovirus. Une deuxième approche du mode
d’action de la protéine P0 résulte de la transformation d’A. thaliana par le gène codant pour
P0 sous le contrôle d'un promoteur inductible. En condition d’induction, ces plantes
présentent un phénotype anormal rappelant certains mutants touchés dans le développement.
L’analyse de l’expression des mRNAs endogènes, cibles de miRNAs a montré que certains
sont surabondants dans les