These de Doctorat de l'Universite Louis PASTEUR
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Français
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01 juin 2004
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102
Langue
Français
Poids de l'ouvrage
2 Mo
Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
These de Doctorat de l'Universite Louis PASTEUR STRASBOURG I presentee par Alain XAYAPHOUMMINE pour obtenir le grade de Docteur de l'Universite STRASBOURG I Specialite : Physique Simulations et experiences sur le repliement de l'ARN : predictions statistiques des pseudonœuds in silico et realisation de commutateurs ARN par transcription in vitro. Soutenue le 18 juin 2004 devant le jury compose de : M. Jean-Louis VIOVY (rapporteur externe) M. Thomas SIMONSON (rapporteur externe) M. Jorg BASCHNAGEL (president du jury) M. Benoıt MASQUIDA (examinateur) M. Didier CHATENAY (directeur) M. Herve ISAMBERT (co-directeur)
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These de Doctorat de l'Universite Louis PASTEUR STRASBOURG I presentee par Alain XAYAPHOUMMINE pour obtenir le grade de Docteur de l'Universite STRASBOURG I Specialite : Physique Simulations et experiences sur le repliement de l'ARN : predictions statistiques des pseudonœuds in silico et realisation de commutateurs ARN par transcription in vitro. Soutenue le 18 juin 2004 devant le jury compose de : M. Jean-Louis VIOVY (rapporteur externe) M. Thomas SIMONSON (rapporteur externe) M. Jorg BASCHNAGEL (president du jury) M. Benoıt MASQUIDA (examinateur) M. Didier CHATENAY (directeur) M. Herve ISAMBERT (co-directeur)
- application pour l'algorithme d'appariement maximum
- prediction de structures secondaires d'arn
- algorithme thermodynamique de mccaskill
- principe de l'algorithme kinefold
- rec¸ues du personnel administratif
- grade de docteur de l'universite strasbourg
- operations administratives courantes
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Thèse de Doctorat de l’Université Louis PASTEUR STRASBOURG I
présentée par Alain XAYAPHOUMMINE
pour obtenir le grade de Docteur de l’Université STRASBOURG I
Spécialité : Physique
Simulations et expériences sur le repliement de l’ARN : prédictions statistiques des pseudonœudsin silicoet réalisation de commutateurs ARN par transcriptionin vitro.
Soutenue le 18 juin 2004 devant le jury composé de :
M. JeanLouis VIOVY M. Thomas SIMONSON M. Jörg BASCHNAGEL M.BenoıˆtMASQUIDA M. Didier CHATENAY M. Hervé ISAMBERT
(rapporteur externe) (rapporteur externe) (président du jury) (examinateur) (directeur) (codirecteur)
Remerciements
i
Je tiens à remercier Didier Chatenay qui m’a accueilli au sein du laboratoire de dynamique des fluides complexes. Didier est un homme entier, amoureux de la science et qui partage son enthousiasme débordant à tous ceux qui ont la chance de le côtoyer. Je remercie Hervé Isambert, qui m’a encadré et guidé tout au long de ce travail. Je le remercie pour sa confiance et pour la liberté qu’il m’a laissées. Je remercie les rapporteurs de cette thèse Jörg Baschnagel, JeanLouis Viovy, Thomas Simonson pour la rapidité avec laquelle ils ont lu mon manuscrit et l’intérêt qu’ils ont portés à mon travail. MerciégalementàBenoıˆtMasquidaquiapristrèsàcœursonrôled’examinateur. J’aimerais remercier l’ensemble des membres du laboratoire de dynamique de fluides complexes, pour les bons moments passé ensembles. En particulier, Fabrice Thalmann avec qui j’ai beaucoup in teragi. Jérôme Robert, qui m’a accueillit dans le groupe de biophysique expérimentale. Carlos Marques si simple dans ses relations et si pertinents dans ses conseils . Nicolas Rivier toujours de bonne humeur et ses petites histoires de physique qui ont égayé des journées de travail parfois longues et fastidieuses. Sans mes deux stagiaires, Thomas Bucher et Myriam Benisty, je n’aurais certainement pas pu obtenir d’interface web aussi sécurisé et fonctionnel, ni pu tester autant de technique de gels de polyacrylamides. Je remercie leur patience, et leur travail exemplaire qu’ils ont fourni lors de leur stage sous ma direction. J’ai beaucoup appris au contact d’autres thésards et j’aimerais les remercier ici pour leurs conseils et les cafés échangés. Je citerais Thierry Marchal, Sébastien Harlepp, Nicolas Douarche et Christian Rick. Jen’oublieraispaslesaidespermanentesre¸cuesdupersonneladministratifettechnique.Na dia Bouaouina et Josianne Haccoun les deux secrétaires du laboratoire, qui ont grandement faci lité toutes les opérations administratives courantes. Patrick Allgayer, et Alain Steyer pour leur cuve d’électrophorèse ” maison ”. Marc Basler pour ses astuces d’électronique. Et je n’oublierais pas Annie Picchinenna qui m’a beaucoup aidé dans la phase de clonage en bactérie. JeanClaude Massot, Céline Xayaphoummine et Thierry Renault, et Céline Pocquet qui ont relu attentivement tout ou partie de ce manuscrit. Merci à tout ce temps qu’ils ont consacré à redonner un peu de rigueur à mon écriture souvent lourde. Enfin, je remercie ma femme, pour m’avoir soutenue et encouragé tout au long de ces années et pour m’avoir donnée la joie d’être papa d’une adorable petite fille, Aurélie.
Table
I
II
des
Introduction
matières
Introduction générale
Simulation numérique
1 Introduction
Simulation numérique 1.1 Structure des ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2 Motifs dans les ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1 Motifs élémentaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.2 Motif pseudonœud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 Prédiction de structures secondaires d’ARN
Prédiction de structures secondaires d’ARN 2.1 Prédiction d’appariement : modèles de base . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Algorithmes de programmation dynamique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1 Principe et application pour l’algorithme d’appariement maximum . . . . . . . 2.2.2 Algorithme MFold . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.3 Algorithme thermodynamique de McCaskill . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Algorithme cinétique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2 Principe de l’algorithmeKineFold. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iii
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3
Accélération de la cinétique [90]
TABLEDESMATIÈRES
Accélération de la cinétique 3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Principe du dépiégeage cinétique exact . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Fusion de deux clusters disjoints. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3.4 Algorithme enO(n) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5 Résultat de l’algorithme d’accélération . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6 Remarques sur la physique du cluster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
Résultats numériques
Résultats numériques 4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 Validation de l’algorithme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3 Relaxation des structures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4 Proportion de pseudonœuds dans des séquences aléatoires courtes . . . . . . . . . . . . 4.4.1 Détection de motif pseudonœuds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.2 Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5 Quantification de l’erreur en négligeant les pseudonœuds . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1 Dénaturation mécanique d’ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
37 37 39 45 49 55 58
61
61 61 61 62 65 65 67 73 74 78
III Approche expérimentale de la cinétique de repliement de molécules d’ARN 81
5
Introduction
Introduction. 5.1 Contexte général . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1 Séquences biologiques et information . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2 Réseaux de mutation neutres : évidence d’une grande adaptabilité des ARN . . 5.1.3 Modulation de la cinétique par le design de la séquence . . . . . . . . . . . . . 5.2 Hypothèses sur repliement cotranscriptionnel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
83
83 83 83 84 86 88
TABLEDESMATIÈRES
6
7
5.3
Stylistique des séquences test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mise en œuvre expérimentale
Mise en œuvre expérimentale 6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2 De l’ADN à l’ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.1 Amplification d’un brin ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.2 Construction et amplification de notre brin matrice en ADN . . . . . . . . . . 6.2.3 Transcription en ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.4Vérificationdesséquencesclonéesparséquenc¸agedirect............. 6.3 Discrimination des structures, gels d’électrophorèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.1 Gels d’agarose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.2 Gels de polyacrylamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.3 Visualisation des polynucléotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.4 ARN natifs et renaturés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Résultats expérimentaux
v
90
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97 97 98 99 102 108 109 109 111 112 114 115
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Résultats expérimentaux 117 7.1 Gels de contrôle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 7.2 Optimisation des gels de polyacrylamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 7.3 Séquence directe Dsma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 7.4 Comparaison avec la séquence réverse Rsma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 7.5 Séquences directes et réverses allongées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 7.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
IV
8
Applications publiques
Visualisation de structures secondaires avec pseudonœuds. RNAMovieswith pseudoknots
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135
vi
9
V
TABLEDESMATIÈRES
Visualisation de strucutres secondaires avec pseudonœuds. RNAMovieswith pseudoknots. 135 8.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 8.2RNAMovies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 8.3 Affichage des pseudonœuds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 8.4 Autres modifications d’intérêt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
ServeurKineFold
ServeurKineFold 9.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.2 Eléments fondateurs du serveur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.3 Mise en œuvre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.3.1 Partie WEB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.3.2 Le gestionnaire de tâches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.3.3 Visualisateur des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.3.4 Interaction des différents éléments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4 Gestion automatique du serveur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.1 Gestion des erreurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.2 Mise à jour des fichiers de résultats sauvegardés . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Conclusion
Conclusion
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Premièrepartie
Introduction
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