UFR DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

Julien Marin

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR UFR DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESE Présentée en vue de l'obtention du titre de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Spécialité : Chimie et Immunologie Thérapeutiques Par Julien MARIN Utilisation de ?-lactames monohydroxylés énantiopurs comme précurseurs d'analogues glycosylés des 4- et 5-hydroxylysines. Application à la synthèse de glycopeptides dérivés du collagène de type II. Soutenue publiquement le 21 Novembre 2003 devant la commission d'examen : Pr. Dr. William D. Lubell Rapporteur externe Pr. Dr. Jean-Charles Quirion Rapporteur externe Pr. Dr. Maurice Goeldner Rapporteur interne Pr. Dr. Horst Kunz Examinateur Dr. Catherine Fournier Examinateur Dr. Gilles Guichard Directeur de thèse

• lubell


• bourse de docteur ingénieur


• yl-oxy-tris


• ufr des sciences de la vie et de la sante


• docteur de l'universite louis


• précurseurs d'analogues glycosylés


• rapporteur interne

Sujets

• Université de Montréal
• Louis Pasteur University
• Guichard
• William
• Fournier
• Université de Rouen

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 novembre 2003
• Nombre de lectures: 43
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

UNIVERSITE LOUIS PASTEUR UFR DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

THESE

Présentée en vue de l’obtention du titre de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Spécialité : Chimie et Immunologie Thérapeutiques

Par Julien MARIN Utilisation deδ-lactames monohydroxylés énantiopurs comme précurseurs d’analogues glycosylés des 4- et 5-hydroxylysines. Application à la synthèse de glycopeptides dérivés du collagène de type II.

Soutenue publiquement le 21 Novembre 2003 devant la commission d’examen :

Pr. Dr. William D. Lubell Pr. Dr. Jean-Charles Quirion Pr. Dr. Maurice Goeldner Pr. Dr. Horst Kunz Dr. Catherine Fournier Dr. Gilles Guichard

Rapporteur externe Rapporteur externe Rapporteur interne Examinateur Examinateur Directeur de thèse

This research work was realised in thelaboratoire d’Immunologie et Chimie Thérapeutique (IBMC, Strasbourg)under the supervision ofDr. G. Guichard and was financed with a grant (Bourse de Docteur Ingénieur) fromNEOSYSTEMand theCNRS. I am deeply indebted toDr. S. MullerandDr. J.-P. Briandfor having me welcomed in the Unit. I would also like to express my gratitude toDr. S. Plaué(C.E.O. ofNEOSYSTEM) for the financial support given in partnership with theCNRS. I am also grateful toPr. W. D. Lubell (Université de Montréal, Canada),Pr. J.-C. Quirion(Université de Rouen),Pr. M. Goeldner (Université Louis-Pasteur),Pr. H. Kunz (Universität Mainz, Deutschland) andDr. C. Fournier (Hôpital Cochin, Paris) for having accepted to judge my research work. My very special thanks go toDr. G. Guichard whose infectious passion for research in organic and medicinal chemistry made my work interesting and exciting. Working withDr. G. Guichardundoubtedly a unique and extremely enriching experience. Additionally, was Dr. G. Guichardhas the gift to see new synthetic routes when others would have only seen undesired side-reactions.

I also would like to express my gratitude toDr.A. Aubry&Dr. C. Didierjean(LCM3B, Nancy) who transformed the crystals into beautiful 3D structures,Dr. C. Fournier who initiate the immunological studies of this project andDr. R. Graff &Dr. J.-D. Sauer (Department of NMR, Strasbourg) who are accomplishing everyday a fantastic job for all the chemists of the university. A special thank goes to all my dear colleagues fromICTmore specifically my lab- and mates (WeiminandDavide) and the two students who worked with me on this project during the course of their DEA, namelyAudeandNathalie. Finally, as you turn this page ofthree years of research, I would like to dedicate this manuscript to my wifeFérielshared with me the successes (and the deceptions) of who research.  Merci …,

Abbreviations : [α] D µL Ac AcOEt AcOH All APC APL bCII Bn Boc BOP cCII CII CFA CIA CSO DBU DCC

optical rotation microliter acetyl ethyl acetate

acetic acid allyl antigen presenting cell altered peptide ligand bovine type II collagen benzyl tert-butyloxycarbonyl benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)hexafluorophosphate chick type II collagen type II collagen complete Freund adjuvant type II collagen induced arthritis 10-(camphorsulfonyl)oxaziridine 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene 1,3-dicyclohexylcarbodiimide

de Dhn DHQ DHQD DIAD DIBAL DIC DIEA DMAP DMARD DMF DPD DTT EDC ee Et EtOH Fmoc FmocOSu g Gal Glc h hCII Hnl Hnv HOAt HOBt Hyl Hz iBu IFA IgG

diastereomeric excess 5,6-dihydroxynorleucine dihydroquinine dihydroquinidine diisopropyl azodicarboxylate diisobutylaluminum hydride 1,3-diisopropylcarbodiimide diisopropylethylamine 4-dimethylaminopyridine disease-modifying anti-rheumatic drug N,N-dimethylformamide dibenzylperoxydicarbonate dithiotreitol N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide enantiomeric excess ethyl ethanol 9H-fluoren-9-ylcarbonyl N-(9H-fluoren-9-ylcarbonyloxy)succinimide gram galactose glucose hour human type II collagen 6-hydroxynorleucine 5-hydroxynorvaline 1-hydroxy-7-azabenzotriazole 1-hydroxybenzotriazole (2S,5R)-5-hydroxylysine herz isobutyl incomplete Freund adjuvant immunoglobulin G

IL-1 iPr J KHMDS LiHMDS M

MALDI-TOF

mCII mCPBA Me MeOH MHC min mL mmol MoOPH Mpm MS Ms MTT NaHMDS NIS NMM NMR p PNB Ph PHAL Piv PPO PTSA RA RP-HPLC RT

interleukin-1 isopropyl coupling constant

potassium hexamethyldisilazide lithium hexamethyldisilazide mole / liter matrix-assisted laser desorption ionization – time of flight mouse type II collagen 3-chloroperoxybenzoic acid methyl methanol major histocompatibility complex minute milliliter millimole MoO 5 •pyridine•HMPA 4-methoxybenzyl molecular sieve methanesulfonyl O-methoxy-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-thyroxine sodium hexamethyldisilazide N-iodosuccinimide N-methylmorpholine nuclear magnetic resonance para para-nitrobenzylcarbonyl phenyl phtalazine pivaloyl trans-2-(phenylsulfonyl)-3-phenyloxaziridine

para-toluenesulfonic acid rheumatoid arthritis reverse phase - high performance liquid chromatography room temperature

SPPS TBAF TBDMS TBDPS t Bu TCR tert TESOTf TFA TFMSA Th-cell THF TIPS TLC TMSOTf TNF t R Z

solid phase peptide synthesis tetrabutylammonium fluoride tertio-butyldimethylsilyl tertio-butyldiphenylsilyl tertio-butyl T-cell receptor tertio triethylsilyl trifluoromethanesulfonate trifluoroacetic acid trifluoromethanesulfonic acid helper T-cell tetrahydrofuran triisopropylsilane thin layer chromatography trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate tumor necrosis factor retention time benzyloxycarbonyl

Résumé (en français) I. Glycopeptides & Autoimmunity in Rheumatoid Arthritis I.1. Rheumatoid arthritis I.1.1. The disease and its symptoms I.1.2. Recent therapeutic strategies I.1.3. Antigens ? CII as a candidate I.1.4. Susceptibility to rheumatoid arthritis I.1.5. T-cells in rheumatoid arthritis I.2. Collagen induced arthritis in mice, a model for rheumatoid arthritis I.2.1. Description of collagen induced arthritis I.2.2. Characterization of tolerogenic T-cell epitopes I.2.3. Collagen induced arthritis in « humanized » mice I.2.4. Aglycopeptide as a T-cell epitope I.3. Preparation of naturally occuring glycosylated CII derivatives I.3.1. Synthesis of protected hydroxylysine and hydroxynorvaline I.3.2. Synthesis of galactosylated building blocks I.3.3. Synthesis of diglycosylated building blocks I.3.4. Synthesis of the CII-derived glycopeptides I.3.5. Binding of CII-derived peptides to MHC molecules I.3.6 Evaluation of T-cell response to CII-derived peptides I.3.7. Schematic description of the ternary complex I.4. Carbohydrate specificity of T-cell hybridomas I.4.1. Preparation of modified galactosyl moiety analogues of CII I.4.2. Specificity of T-cell hybridomas obtained in CIA I.4.3. Further evaluation of the role of HO-4 I.5. Preparation and evaluation of a CII-analogue carrying aC-glycoside I.5.1. Synthesis of C-galactosylated Hnv and incorporation into CII(256-270) I.5.2. Immunological study II. Objectives and Synthetic Issues II.1. A brief statement

II.2. Objectives : a new set of CII-glycopeptides for the determination of the fine

specificity of T-cells II.3. Synthetic strategy II.3.1. General considerations II.3.2. Synthesis of conveniently protected hydroxylysine analogues II.3.2.1. The divergent approach II.3.2.2. Pseudo-allylic A(1,3) strain II.3.3. Synthesis of β -galactosylated building blocks III. Preparation of 5-Hydroxylysine Analogues III.1. A new strategy for the preparation of (2S,5R)-5-hydroxylysine III.1.1. Reported synthetic methods III.1.2. The proposed strategy III.1.3. δ -Lactams synthesis III.1.4. α -Hydroxylation studies

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9 9 11 11 12 13 14 14 16 18 19 21 22 23 25 27 29 29 31 32 32 34 35 36 36 37

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III.1.4.1. Preparation of the oxidizing agents III.1.4.2. Optimization of the hydroxylation step III.1.4.3. Extension to other piperidinones III.1.4.4. A possible improved strategy III.1.5. Synthesis of protected (2S,5R)-5-hydroxylysine derivative

III.1.6. Determination of the stereomeric purity of synthetic 5-hydroxylysine

III.1.7. Synthesis of (+)-pyridinoline precursors III.2. Synthesis of unnatural 5-hydroxylysine analogues III.2.1. Synthesis of (2S,5R)-5,6-dihydroxynorleucine derivative III.2.2. Synthesis of (2S,5S)-5-hydroxylysine derivative III.2.3. Synthesis of (2S,5S)-5-azido-6-hydroxynorleucine III.2.4. Synthesis of (2S,5R)-5-hydroxy-5-methyllysine derivative IV. Preparation of 4-Hydroxylysine Analogues IV.1. A versatile strategy IV.1.1. Retrosynthesis IV.1.2. 4,6-Dioxopiperidines synthesis IV.1.3. The keto-enolic equilibrium in the dioxopiperidines IV.1.4. Diastereoselective reduction studies IV.1.5. Influence of theN-acylation IV.1.6. Evaluation of new reducing conditions IV.1.7. Synthesis of (2S,4S)-4-hydroxylysine IV.1.8. Preparation of a 4-hydroxylysine aglycon IV.2. Synthesis of N-Fmoc protected 4-hydroxypipecolic acids IV.2.1. Interests in 4-hydroxypipecolic acids IV.2.2. Preparation of (2S,4R)-4-hydroxypipecolic acid IV.2.3. Preparation of (2S,4S)-4-hydroxypipecolic acid V. Synthesis of Glycosylated Building Blocks V.1. Reported syntheses of β -galactosylated 5-hydroxylysine V.2. Optimized conditions for our aglycons V.2.1. Strategies using acetylated galactosyl donors V.2.2. Orthoester formation and rearrangement V.2.3. A modified protecting group strategy V.2.4. β -Galactosylated (2S,5R)-5-hydroxylysine building blocks V.2.5. Glucosylated (2S,5R)-5-hydroxylysine building block V.3. Galactosylation of the 5-hydroxylysine mimetics VI. Preparation of CII-derived Peptides and Glycopeptides VI.1. Elongation of the peptidic chain on solid support VI.2. Deprotection strategy VI.2.1. Reduction of the azido function and clivage from solid support VI.2.2. Deprotection of the glycosyl moiety VI.3. List of peptides and glycopeptides VII. Immunological Assays

60 62 66 68 70 72 74 76 76 76 77 79

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VII.1. Materials and methods VII.1.1. Generation of CII-specific T-cell hybridomas VII.1.2. Generation of the CII-specific T-cell clone VII.1.3. Measurement of T-cells reactivity VII.2. T-cell recognition of glycopeptides VII.2.1. Evaluation of the natural peptides VII.2.2. Glycopeptides modified at the ε -primary amine VII.2.3. Modulation of the galactosyl moiety

VII.2.4. Glycopeptides with GalHyl derivatives modified at C-5

VIII. Conclusion and Perspectives VIII.1. The divergent stereocontrolled strategy VIII.2. Determination of the fine specificity of T-cells

VIII.3. Perspectives : synthesis ofS- andC-glycoside analogues of GalHyl

IX. Experimental Section IX.1. General IX.2. Materials IX.3. Compounds cited in section III IX.4. Compunds cited in section IV IX.5. Compounds cited in section V IX.6. Peptides cited in section VI IX.7. Supplementary material IX.7.1. Crystal data and structure refinement for61a IX.7.2. Crystal data and structure refinement for (5R)-63a IX.7.3. Crystal data and structure refinement for64a IX.7.4. Crystal data and structure refinement for64c IX.7.5. Crystal data and structure refinement for153a IX.7.6. Crystal data and structure refinement for153c IX.7.7. Crystal data and structure refinement for155c IX.7.8. Crystal data and structure refinement for156c IX.7.9. Crystal data and structure refinement for179 IX.7.10. Crystal data and structure refinement for180

117 117 117 118 118 118 120 121 122

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Résumé :

Introduction

Résumé

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est l’une des maladies auto-immunes systémiques les plus 1 fréquentes avec une prévalence d’environ 0.8%. Elle se caractérise essentiellement par l’inflammation chronique des articulations qui peut mener à long terme à des déformations gravement invalidantes. La prédilection de l’attaque inflammatoire pour les articulations et la présence de taux élevés d’auto-anticorps anti-collagène de type II dans le sérum et les articulations de patients atteints de PR indique un rôle du collagène de type II (CII) comme source possible de peptide(s) antigénique(s). Par ailleurs, la forte association entre la susceptibilité à la PR et l’expression de certains gènes montre le rôle du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH II) comme récepteur de ce(s) peptide(s). Enfin, les infiltrats massifs de + cellules T CD4 dans les articulations de patients atteints de PR suggère un rôle central des cellules T. Ces trois éléments joueraient donc un rôle crucial dans la PR sous forme d’une + interaction ternaire/ peptide dérivé de CII / molécule de CMH »« cellule T CD4 . Il existe un certain nombre de modèles animaux de PR, le plus utilisé étant l’arthrite expérimentale au collagène (AEC). Dans ce modèle, plusieurs groupes ont mis en évidence la présence d’un épitope T immunodominant ayant comme séquence minimum CII(260-267). De la même manière, les résultats obtenus plus récemment dans des modèles de souris « humanisées » montrent que la séquence comprenant les résidus 263-270 correspond à la séquence minimale immunodominante présentée par des molécules CMH humaines. L’une des caractéristiques importantes du CII réside dans les différentes modifications post-traductionelles qui génèrent à partir d’une même séquence une multitude de variants possibles. Dans le cas de l’épitope CII(256-270), les possibilités d’hydroxylation des résidus proline ou lysine suivie de la glycosylation des résidus hydroxylysine sous forme deβ-D- galactopyranosyle ouα-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranosyle génère un groupe de 64 peptides ou glycopeptides naturels différents.

1 statistics from the WHO Statistical Information System (WHOSIS),http://www3.who.int/whosis/menu.cfm

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