UNIVERSITÉ DE STRASBOURG École doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

Tiphaine Huet

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
1 UNIVERSITÉ DE STRASBOURG École doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé THÈSE Présentée pour l'obtention du titre de : Docteur de l'Université de Strasbourg Discipline : Sciences du vivant Mention : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie Par Tiphaine HUET EXPLOITATION DE LA RELATION STRUCTURE-FONCTION DU RÉCEPTEUR NUCLÉAIRE DE LA VITAMINE D POUR L'ÉLUCIDATION DES MÉCANISMES DE LA SIGNALISATION DE LA VITAMINE D Soutenue le 8 juin 2010 devant le jury : Rapporteur externe Professeur Vincent Laudet, Lyon, France Rapporteur externe Professeur Roger Bouillon, Louvain, Belgique Rapporteur interne Docteur Philippe Dumas, Strasbourg, France Directeur de thèse Docteur Dino Moras, Illkirch, France Thèse préparée au sein du Département de Biologie Structurale et Génomique de l'Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire UDS, CNRS UMR7104, INSERN U964, Illkirch, France

• modèle tridimensionnel du vdr de poisson-zèbre


• gemini


• cavité de fixation du ligand


• modèle tridimensionnel du mutant vdrl337h de poisson-zèbre


• ancien membre


• expériences de spectrométrie de masse esi-tof


• détermination des affinités relatives des ligands bxl


• methodes de biologie moleculaire

Sujets

• Rochel
• Bouillon
• González
• Gemini

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 juin 2010
• Nombre de lectures: 105
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 10 Mo

Extrait

UNIVERSITÉ DE STRASBOURG
École doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé


THÈSE

Présentée pour l’obtention du titre de :
Docteur de l’Université de Strasbourg
Discipline : Sciences du vivant
Mention : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie

Par

Tiphaine HUET

EXPLOITATION DE LA RELATION STRUCTURE-FONCTION
DU RÉCEPTEUR NUCLÉAIRE DE LA VITAMINE D POUR
L’ÉLUCIDATION DES MÉCANISMES DE LA SIGNALISATION
DE LA VITAMINE D

Soutenue le 8 juin 2010 devant le jury :

Rapporteur externe Professeur Vincent Laudet, Lyon, France
Rapporteur externe Professeur Roger Bouillon, Louvain, Belgique
Rapporteur interne Docteur Philippe Dumas, Strasbourg, France
Directeur de thèse Docteur Dino Moras, Illkirch, France

Thèse préparée au sein du Département de Biologie Structurale et Génomique
de l’Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
UDS, CNRS UMR7104, INSERN U964, Illkirch, France
1 Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier Vincent Laudet, Roger Bouillon et Philippe Dumas pour avoir
accepté de juger mon travail de thèse,
Je remercie vivement Dino Moras pour m’avoir fait confiance en m’accueillant dans son
laboratoire et Natacha Rochel pour m’avoir encadré, pour sa disponibilité, ses conseils et son
soutien.
Je remercie Fabrice Ciesielski qui a commencé le projet.
Mes remerciements vont aussi aux membres de l’équipe : Judith, Maria, Carole, Pierre pour leurs
précieux conseils. Je remercie vivement les anciens membres Teru pour m’avoir aidé et conseillé
en cristallisation et cristallographie, Nick pour m’avoir initiée à la polarisation de fluorescence. Je
remercie également André pour son aide durant la congélation et l’acquisition des données.
J’adresse mes remerciements à tous les membres du Département de Biologie Structurale et
Génomique, les membres de la plateforme LBGS Loubna, Edouard, Alastair, Pierre, Catherine et
Didier pour leurs conseils en biologie moléculaire, purification de protéines, cristallisation et
collecte des données synchrotron. Je remercie chaleureusement les personnes du module 1065
(Benoit, Nicolas, Yann, Sylvia, Julie), Isabelle et Alexandra mes anciennes voisines de paillasses
et tous mes collègues du CEBGS, trop nombreux pour tous les citer.
Je remercie Noëlle, Hélène, Manuela, Cédric, Daniel, Adeline et Frank pour leur disponibilité
dans les expériences de masse spectrométrie.
Je tiens à remercier également Anne, Laetitia et Armelle pour leur précieuse aide dans les tâches
administratives.

Je remercie le Conseil Régional d’Alsace et la société Novalix pour avoir financé mes trois
années de thèse et l’ARC pour m’avoir accordé un financement supplémentaire de six mois.

Enfin je tiens à remercier tout particulièrement mes parents, ma sœur et mon frère pour m’avoir
soutenu et encouragé dans mes choix et dont l’affection a été précieuse durant le déroulement de
ce travail.
Je remercie également Maria Gonzalez pour s’être si bien occupée de ma fille Hyaline ces trois
dernières années.
2 SOMMAIRE.
1. SOMMAIRE.......................................................................................................................................................... 3
2. ABRÉVIATIONS.................................................................................................................................................. 6
3. INDEX DES FIGURES ET TABLEAUX........................................................................................................... 9
4. I- INTRODUCTION........................................................................................................................................... 13
I.1. LE RECEPTEUR NUCLEAIRE DE LA VITAMINE D : VDR. ...................................................................................... 15
I.1.1. Organisation modulaire du VDR............................................................................................................... 15
I.1.2. Mécanisme moléculaire de l’activation du VDR....................................................................................... 17
I.1.3. Corépresseurs, coactivateurs et VDRE. .................................................................................................... 18
I.2. LES EFFETS NON-GENOMIQUES DE LA VITAMINE D. ........................................................................................... 22
I.2.1. Rôle du récepteur cytosolique 1,25D3-MARRS dans les fonctions non-génomiques................................ 25
I.2.2. Outils d’étude in vivo. ............................................................................................................................... 28
I.2.3. Inconvénients, limitations de ces outils..................................................................................................... 31
5. II- OBJECTIF DE L’ÉTUDE............................................................................................................................ 32
6. III- MÉTHODES. ............................................................................................................................................... 33
III.1. MUTAGENESE DIRIGEE. ................................................................................................................................... 33
III.1.1. Protocole utilisé...................................................................................................................................... 33
III.1.2. Problèmes rencontrés. ............................................................................................................................ 34
III.1.3. Protocole retenu. .................................................................................................................................... 35
III.2. EXPRESSION ET PURIFICATION DU DOMAINE DE FIXATION DU LIGAND DU MUTANT ZVDR . ..................... 36 L337H
III.2.1. Production DU zVDR dans E. coli. ................................................................................................ 36 L337H
III.2.2. Préparation de l´extrait brut. ................................................................................................................. 37
III.2.3. Étape de chromatographie d´affinité sur résine chélatant les ions cobalt. ............................................ 37
III.2.4. Étape de protéolyse du polypeptide de fusion N-terminal. ..................................................................... 38
III.2.5. Étape de chromatographie par exclusion de taille. ................................................................................ 38
III.2.6. Formation du complexe récepteur/ligand/peptide coactivateur............................................................. 39
III.3. ÉTUDE CRISTALLOGRAPHIQUE DES COMPLEXES ZVDR-LBD/LIGANDS/PEPTIDE COACTIVATEUR. .................. 40
III.3.1. Principe. ................................................................................................................................................. 40
III.3.2. Condition et technique de cristallisation utilisée.................................................................................... 40
III.3.3. Optimisation des cristaux. ...................................................................................................................... 41
III.3.4. Cristaux obtenus et problèmes rencontrés.............................................................................................. 41
III.3.5. Solutions. ................................................................................................................................................ 42
III.3.6. Traitement des données de diffraction.................................................................................................... 43
3 III.4. DETERMINATION DES AFFINITES RELATIVES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE.................................................. 46
III.4.1. Méthode utilisée : ESI-TOF.................................................................................................................... 46
III.4.2. Préparation de l’échantillon................................................................................................................... 47
III.5. EXPERIENCES DE TRANSACTIVATION PAR LA TECHNIQUE DU GENE-RAPPORTEUR........................................... 47
III.5.1. Culture des cellules MCF-7.................................................................................................................... 47
III.5.2. Transfection des cellules...................................