UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I

Valérie Goldschmidt

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESE présentée pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Discipline : Sciences du vivant Spécialité : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie par Valérie GOLDSCHMIDT LA RETROTRANSCRIPTION DE HIV-1 : ETUDE DU COMPLEXE D'INITIATION ET DES MECANISMES DE RESISTANCE AUX INHIBITEURS NUCLEOSIDIQUES Soutenue le 3 décembre 2004 devant la Commission d'examen Dr. R. MARQUET Directeur de thèse Prof. B. EHRESMANN Directeur de thèse Dr. S. MULLER Rapporteur interne Dr. M. GOTTE Rapporteur externe Dr. C. BRANLANT Rapporteur externe Dr. C. EHRESMANN Examinateur UPR 9002 du CNRS, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg

• recrutement des arn dans l'assemblage


• structure du complexe binaire


• mécanisme d'excision de l'aztmp


• recrutement des protéines virales dans l'assemblage


• synthèse de l'adn


• réaction enzymatique d'incorporation de nucléotides


• résistance aux nrti


• hiv


• adn proviral

Sujets

• Goldschmidt
• Réplication de l'ADN
• ADN proviral

Informations

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• Publié le: 01 décembre 2004
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Extrait

UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG I

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

THESE

présentée pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR Discipline: Sciences du vivant Spécialité: Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie

par

Valérie GOLDSCHMIDT

LA RETROTRANSCRIPTION DE HIV-1 : ETUDE DU COMPLEXE D’INITIATION ET DES MECANISMES DE RESISTANCE AUX INHIBITEURS NUCLEOSIDIQUES

Soutenue le 3 décembre 2004 devant la Commission d’examen

Dr. R. MARQUET Prof. B. EHRESMANN Dr. S. MULLER Dr. M. GOTTE Dr. C. BRANLANT Dr. C. EHRESMANN

Directeur de thèse Directeur de thèse Rapporteur interne Rapporteur externe Rapporteur externe Examinateur

UPR 9002 du CNRS, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg

SOMMAIRE

ABREVIATIONS.................................................................................................................................................. 7

AVANT-PROPOS ............................................................................................................................................... 11

INTRODUCTION............................................................................................................................................ 15

CHAPITRE I : LE VIRUS DE L’IMMUNODÉFICIENCE HUMAINE DE TYPE 1 ................................. 17

I. Historique, caractéristiques et classification ........................................................................................... 17 A. Les Retroviridae ou Rétrovirus............................................................................................................................ 17 1. Définition et origine des rétrovirus.................................................................................................................. 17 2. Caractéristiques générales ............................................................................................................................... 19 3. Classification................................................................................................................................................... 19

B. Le genre lentivirus de la famille des Rétroviridae et HIV-1 ................................................................................ 20 1. Caractéristiques morphologiques et moléculaires ........................................................................................... 20 2. Caractéristiques biologiques et cliniques......................................................................................................... 21 a. Communes à tous les lentivirus.................................................................................................................. 21 b. Cas de HIV-1 ............................................................................................................................................. 21 C. Origine et évolution de HIV................................................................................................................................. 23 II. Organisation génétique et structure du virion de HIV-1 ........................................................................ 25 A. Organisation génétique ........................................................................................................................................ 25 1. L’ADN proviral............................................................................................................................................... 25 a. Les régions non codantes ........................................................................................................................... 25 b. Les régions codantes .................................................................................................................................. 25 i. Les protéines de structure et enzymatique ............................................................................................. 27

ii. Les protéines régulatrices et auxiliaires ................................................................................................ 28 2. L’ARN viral .................................................................................................................................................... 28 a. La région 5’ ................................................................................................................................................ 28 i. La séquence R en 5’et 3’ ....................................................................................................................... 28 ii. La séquence PBS .................................................................................................................................. 30 iii. La région leader................................................................................................................................... 30 b. Les signaux internes................................................................................................................................... 30 i. Les sites d’épissage ............................................................................................................................... 30 ii. La séquence RRE ................................................................................................................................. 30 iii. Les séquences polypuriniques PPT 3’ et PPTc.................................................................................... 30 B. Structure du virion ............................................................................................................................................... 31 1. L’enveloppe .................................................................................................................................................... 31 2. La matrice ....................................................................................................................................................... 31 3. La capside ....................................................................................................................................................... 33 a. La protéine de capside................................................................................................................................ 33 b. La nucléocapside........................................................................................................................................ 33 c. La protéine p6 ............................................................................................................................................ 34

1

d. Le peptide p2 ............................................................................................................................................. 34 e. Les protéines enzymatiques........................................................................................................................ 34 i. La protéase ............................................................................................................................................ 34 ii. La rétrotranscriptase ............................................................................................................................. 34 iii. L’intégrase........................................................................................................................................... 35 f. Les protéines auxiliaires ............................................................................................................................. 35 i. La protéine Virale R : Vpr ..................................................................................................................... 35 ii. Facteur Négatif : Nef ............................................................................................................................ 35 iii. Facteur d’Infectivité Virale : Vif ......................................................................................................... 37 g. Autres constituants encapsidés .................................................................................................................. 37 III. Le cycle réplicatif de HIV-1................................................................................................................... 39 A. La phase pré-intégrative ..................................................................................................................................... 39 1. La reconnaissance, la fusion membranaire et l’entrée du virus dans la cellule hôte........................................ 39 2. Les étapes de décapsidation et de rétrotranscription........................................................................................ 41 3. Le transport intranucléaire de l’ADN proviral ................................................................................................ 43 4. L’intégration de l’ADN proviral ..................................................................................................................... 45 B. La phase post-intégrative ..................................................................................................................................... 47 1. Expression de l’ADN proviral......................................................................................................................... 47 a. La phase précoce ........................................................................................................................................ 47 i. L’initiation de la transcription ............................................................................................................... 47 ii. Epissage des ARNm viraux .................................................................................................................. 48 b. La phase tardive ......................................................................................................................................... 51 i. Export nucléaire des ARNm viraux mono et non-épissés...................................................................... 51 ii. Traduction des ARNm viraux mono et non-épissés ............................................................................. 51 2. Assemblage des virions, bourgeonnement et maturation ................................................................................ 52 a. Le recrutement des protéines virales dans l’assemblage ............................................................................ 52 b. Le recrutement des ARN dans l’assemblage.............................................................................................. 53 i. Le recrutement de l’ARN viral .............................................................................................................. 53 Lys ii. Le recrutement de l’ARNt 3 ............................................................................................................... 53 c. Le bourgeonnement et la maturation du virion........................................................................................... 55

CHAPITRE II : LA RÉTROTRANSCRIPTION CHEZ HIV-1 .................................................................... 59

I. La rétrotranscription................................................................................................................................ 59 A. L’initiation et la synthèse de l’ADN « Strong-Stop » (-) ..................................................................................... 59 B. Le premier transfert de brin ................................................................................................................................. 60 C. La synthèse du brin d’ADN (-) ............................................................................................................................ 60 D. L’initiation de la synthèse du brin (+).................................................................................................................. 61 E. Le second transfert de brin ................................................................................................................................... 61 F. La terminaison de la rétrotranscription................................................................................................................. 61 II. Le complexe d’initiation ......................................................................................................................... 63 A. Structure secondaire du domaine PBS des virus de sous-types A et B de HIV-1 ................................................ 63 B. Le complexe d’initiation de la rétrotranscriptionin vitro..................................................................................... 65 Lys 1. Structure du complexe binaire ARNt 3 /ARNv de l’isolat MAL de HIV-1 ................................................... 65 Lys 2. Structure du complexe binaire ARNt 3 /ARNv des isolats Hxb2/Lai/NL4-3 de HIV-1................................. 67 Lys 3. Structure du complexe ternaire ARNt 3 /ARNv : RT .................................................................................... 69

2

4. Spécificité fonctionnelle du complexe d’initiation .......................................................................................... 69 C. L’initiation de la rétrotranscription en culture cellulaire...................................................................................... 70 1. Réplication de virus mutants ........................................................................................................................... 70 2. Les protéines impliquées dans le processus de rétrotranscription ................................................................... 72 a. Les protéines virales impliquées dans la rétrotranscription ........................................................................ 72 b. Les protéines cellulaires impliquées dans la rétrotranscription .................................................................. 74 D. La structure du complexe d’initiation chez d’autres rétrovirus et rétroéléments.................................................. 74 1. HIV-2 .............................................................................................................................................................. 74 2. FIV .................................................................................................................................................................. 75 3. RSV................................................................................................................................................................. 76 4. MLV................................................................................................................................................................ 77 5. Ty1 .................................................................................................................................................................. 78 6. Ty3 .................................................................................................................................................................. 78

CHAPITRE III : L’INHIBITION DE LA RÉTROTRANSCRIPTION DE HIV-1 ..................................... 81

I. La rétrotranscriptase ............................................................................................................................... 81 A. Structure tridimensionnelle de la RT ................................................................................................................... 81 1. Les domaines structuraux de la RT ................................................................................................................. 83 a. La sous-unité p66 ....................................................................................................................................... 83 b. La sous-unité p51 ....................................................................................................................................... 84 2. Comparaison des structures cristallographiques de la RT libre ou liée ........................................................... 84 3. Structure des duplex ADN/ADN ou ADN/ARN ............................................................................................. 85 4. Le site de fixation du nucléotide ..................................................................................................................... 88 B. Mécanisme de polymérisation par la RT.............................................................................................................. 89 1. Réaction enzymatique d’incorporation de nucléotides .................................................................................... 89 2. Processivité de la RT....................................................................................................................................... 90 II. Les inhibiteurs de la rétrotranscriptase.................................................................................................. 91 A. Les inhibiteurs non nucléosidiques ...................................................................................................................... 91 B. Les inhibiteurs nucléosidiques et nucléotidiques ................................................................................................ 92 1. Structure des NRTI ......................................................................................................................................... 92 2. Mécanisme d’action ........................................................................................................................................ 94 a. La phosphorylation et l’incorporation dans la chaîne d’ADN .................................................................... 94 III. Résistance aux inhibiteurs de la RT....................................................................................................... 96 A. Mode d’apparition des virus résistants................................................................................................................. 96 1. Fidélité de la RT.............................................................................................................................................. 96 2. La recombinaison ............................................................................................................................................ 96 B. Les mécanismes de résistance aux inhibiteurs de la rétrotranscriptase ................................................................ 97 1. Résistance aux NNRTI.................................................................................................................................... 97 2. Résistance aux NRTI....................................................................................................................................... 97 a. Mécanisme de discrimination................................................................................................................... 100 b. Mécanisme d’excision.............................................................................................................................. 100 c. Cas du Ténofovir...................................................................................................................................... 100 OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE....................................................................................................... 123 RESULTATS ET DISCUSSION .................................................................................................................. 127

3

C HAPITRE I : E TUDE DU COMPLEXE D ’ INITIATION DE LA RÉTROTRANSCRIPTION ............................................ 129 Lys I. Article I : Etude du complexe ARNt 3 /ARNv de l’isolat MAL .............................................................. 129 A. Objectifs ............................................................................................................................................................ 129 B. Méthodologie ..................................................................................................................................................... 129 1. Etude Structurale : cartographie en solution.................................................................................................. 129 a. Les sondes utilisées .................................................................................................................................. 131 i. Les sondes chimiques .......................................................................................................................... 131 b. Les sondes enzymatiques ......................................................................................................................... 131 2. Détection des clivages et des positions modifiées ......................................................................................... 131 C. Conclusions........................................................................................................................................................ 145 His II. Article II. Relations entre la structure et la fonction du complexe d’initiation utilisant l’ARNt comme amorce ....................................................................................................................................................... 147

A. Objectifs ............................................................................................................................................................ 147 B. Résultats-Conclusions........................................................................................................................................ 161 III. Article III : Existe-il une interaction alternative PAS/anti-PAS ? ....................................................... 163 A. Objectifs ............................................................................................................................................................ 163 B. Résultats-Discussion-Conclusions ..................................................................................................................... 175 IV. Article IV : La versatilité du complexe d’initiation de la rétrotranscription de HIV-1 ....................... 179 A. Objectifs ............................................................................................................................................................ 179 B. Résultats-Discussion .......................................................................................................................................... 191 C HAPITRE II : M ÉCANISME D ’ EXCISION DE L ’AZTMP : RÔLE DE L ’ATP- LYSE ?............................................ 199 I. Introduction............................................................................................................................................ 199 II. Etat d’avancement des travaux ............................................................................................................. 201 III. Stratégie expérimentale ....................................................................................................................... 202 IV. Résultats et discussion ......................................................................................................................... 203

A. Activité des enzymes sauvage et résistante........................................................................................................ 203 B. Incorporation de l’AZTTP ................................................................................................................................. 203 C. Mécanisme de résistance par enlèvement ......................................................................................................... 203 1. Enlèvement par PP-lyse ................................................................................................................................ 203 2. Enlèvement par ATP-lyse ............................................................................................................................. 205 D. Existe-t-il une compétition entre l’ATP et le PPi pour exciser l’AZTMP incorporé ? ...................................... 207 2+ C HAPITRE III : R ÔLES MULTIPLES DE LA CONCENTRATION EN M G ............................................................... 211 I. Introduction............................................................................................................................................ 211 II. Résultats et discussion .......................................................................................................................... 215 2+ A. Influence de la concentration en Mg sur la synthèse d’ADN « Strong-Stop » (-) ........................................... 215 2+ 1. Influence de la concentration en Mg sur l’activité polymérase................................................................... 217 a. Sur la vitesse d’incorporation de nt .......................................................................................................... 217 b. Sur la processivité .................................................................................................................................... 219 2+ 2. Influence de la concentration en Mg sur l’activité RNase H polymérase dépendante ................................ 219 2+ B. Influence de la concentration en Mg sur l’inhibition de la synthèse d’ADN « Strong-Stop » (-) en présence de différents NRTI ...................................................................................................................................................... 223

4

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .......................................................................................................... 231

I. Versatilité du complexe d’initiation ....................................................................................................... 233 II. Rôles de l’ATP-lyse dans le mécanisme de réparation d’une amorce terminée par de l’AZT.............. 237 2+ III. Rôles multiples de la concentration en Mg ....................................................................................... 238 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................................... 241

5

Sommaire

6

A aa ADN ARN ARNm ARNt His ARNt Lys ARNt 1,2 Lys ARNt 3 Met ARNt Glu ARNt ARNv ATP AZT AZTTP C CA CMCT coll. CTS dCTP ddGTP DIS DMS dNTP dTTP E. coli env G gag GTP/GDP

Abréviations

ABREVIATIONS

adénine acide aminé acide désoxyribonucléique acide ribonucléique ARN messager ARN de transfert ARN de transfert spécifique de l’histidine isoaccepteurs 1 et 2 de l’ARN de transfert spécifique de la lysine isoaccepteur 3 de l’ARN de transfert spécifique de la lysine ARN de transfert spécifique de la méthionine ARN de transfert spécifique de l’acide glutamique ARN viral adénosine 5'-triphosphate 3'-azido-3'-désoxythymidine 3'-azido-3'-désoxythymidine 5'-triphosphate cytosine « capsid protein » 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide-métho-p-toluène sulfonate collaborateurs « central termination sequence » 2'-désoxycytidine 5'-triphosphate 2', 3'-didésoxyguanosine 5'-triphosphate « dimerization initiation site » sulfate de diméthyle 2'-désoxyribonucléotide 5'-triphosphate thymidine 5'-triphosphate Escherichia coli « envelope » guanine « group-specific antigen » guanosine 5'-triphosphate/diphosphate

7

HMG IN kb K d kD k off k pol LTR MA min Nef NC NES NLS NNRTI NRTI ODN ORN nt PAS PBS PIC pol PPi PPT PR

Psi A/M R Rev RMN RNase H RRE RT SA

« high mobility group »

Abréviations

« integrase » kilobase constante d'équilibre de dissociation kiloDalton constante de vitesse de dissociation constante de vitesse de polymérisation « long terminal repeat » « matrix protein » minute « negative factor » « nucleocapsid protein » « nuclear export signal » « nuclear localization signal » inhibiteur non-nucléosidique de la RT inhibiteur nucléosidique de la RT oligodésoxyribonucléotide complémentaire des 18 nt du PBS oligoribonucléotide complémentaire des 18 nt du PBS nucléotide « primer activation signal » « primer binding site » « preintegration complex » « polymerase » pyrophosphate inorganique « polypurine tract » « protease » « packaging signal » amorce/matrice « redundant» « regulator of virion expression » résonance magnétique nucléaire « ribonuclease H » « rev responsive element » « reverse transcriptase » « splice acceptor»

8

SD SIDA T TAR TAM Tat u U U3 U5 Vif Vpr Vpu

Abréviations

« splice donor » syndrôme d'immuno-déficience acquise thymine « trans-acting responsive element » « thymidine analogue mutations » « transactivator » unité enzymatique uracile « unique sequence element at the 3’ end of the viral RNA» « unique sequence element at the 5’ end of the viral RNA » « viral infectivity factor » « viral protein R » « viral protein U »

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