The essential numerical range and the Olsen problem

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The essential numerical range and the Olsen problem Vladimir Müller Lille, 2010 Vladimir Müller The essential numerical range and the Olsen problem

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N˚d’ordre : 2251
`These
pr´esent´ee
pour obtenir
le titre de docteur
de l’institut national polytechnique de toulouse
´Ecole Doctorale : Biologie-Sant´e-Biotechnologies
Sp´ecialit´e : Biosciences V´eg´etales
Par M. C´edric Muller
Titre de la th`ese
D´eveloppement d’une m´ethodologie d’analyse de la
conservation de synt´enie chez les plantes
Du g´enome d’Arabidopsis `a celui du Tournesol
Soutenue le 22 Septembre 2005 devant le jury compos´e de :
Pr´esident C. Chevalet Directeur du G´enopˆole Midi-Pyr´en´ees, Toulouse
Rapporteur P. Leroy Directeur de Recherche, INRA, Clermont-Ferrand
Rapporteur S. Mouzeyar Charg´e de Recherche, INRA, Clermont-Ferrand
Examinateur T. Faraut Charg´e de Recherche, INRA, Toulouse
Co-Directeur L. Gentzbittel Professeur d’universit´e, ENSAT, Toulouse
Co-Directeur C. Bri`ere Charg´e de Recherche, CNRS, Toulouse
c C´edric Muller, 2005iiR´esum´e
Letournesol(Helianthus annuus L)estl’unedesprincipalesplantesol´eagineuses cultiv´ees.
L’´etudedesg`enessoustendantlesprincipauxcaract`eres agronomiquesestdifficileenraisonde
son grand g´enome pour lequel peu d’informations existent. Par ailleurs, les moyens financiers
et techniques sont loin d’ˆetre comparables `a ceux mis en place pour les c´er´eales ou d’autres
v´eg´etaux (carte physique, s´equenc¸age en masse de g´enome, d’ARNm, recherche des duplica-
tions, des transposons...). Pour ´etudier l’organisation du g´enome du tournesol, il a donc ´et´e
envisag´e une approche diff´erente bas´ee sur la conservation de synt´enie avec la plante mod`ele
Arabidopsis thaliana. Les informations relatives aux g`enes de la plante mod`ele transf´er´ees aux
s´equences ESTet ARNmdu tournesol permettent d’optimiser l’exploitation de ces s´equences.
Mon travail de th`ese a donc consist´e a` mettre au point une m´ethode d’analyse massive du
grand nombre de s´equences de tournesol puis de tester exp´erimentalement les r´esultats de
cette analyse afin d’obtenir de nouvelles informations sur l’organisation du g´enome du tour-
nesol et d’estimer la conservation de synt´enie avec Arabidopsis.
La mise en place de la m´ethodologie a abouti a` la cr´eation d’un serveur web appel´e Iccare.
Cetoutil bioinformatiquepermetla comparaison et l’analyse d’ungrandnombredes´equences
de diff´erents organismes v´eg´etaux ou animaux avec les s´equences codantes des g`enes de l’or-
ganisme mod`ele respectif, Homo sapiens pour les animaux et Arabidopsis thaliana pour les
v´eg´etaux. Les r´esultats sont pr´esent´es sous forme graphique en combinant les informations de
similitudes aux informations structurales des g`enes de l’organisme mod`ele (introns, r´egions
UTR). La combinaison de ces informations permet ainsi d’optimiser l’exploitation de ces
s´equences en utilisant les outils coupl´es `a Iccare (d´efinir des amorces ou des sondes). En
compl´ement de Iccare, Synteny Search (en cours d’ach`evement) est un site web qui permet
de rechercher les relations existantes entre les g`enes d’Arabidopsis et du riz (conservation de
synt´enie) ainsi que les relations de ces g`enes au sein d’un mˆeme g´enome (ils sont uniques,
dupliqu´es ou appartiennent a` des familles multig´eniques). Cet outil donne des informations
compl´ementaires sur les g`enes s´electionn´es `a partir d’Iccare afin de v´erifier et d’interpr´eter les
r´esultats exp´erimentaux (nombre de fragments amplifi´es ou de clones BAC positifs).
Iccare a permis de s´electionner, parmi 60 200 s´equences de tournesol, 20 691 s´equences
pr´esentant des similitudes avec 3 635 g`enes d’Arabidopsis. L’organisation du g´enome du tour-
nesoletlaconservationdesynt´enieavecArabidopsis ont´et´e´etudi´eesenutilisantdess´equences
EST de tournesol qui pr´esentaient des similitudes avec 195 g`enes localis´es sur le chromosome
5 de la plante mod`ele. Cent cinquante neuf d’entre elles ont servi `a d´efinir des sondes Overgodansdeuxr´egionsdiff´erentes.Lecriblaged’unebanquedeclonesBACaveccessondespr´esente
une efficacit´e sup´erieure `a 70%. Des amplifications PCR sur une quarantaine de clones BAC
positifs ont permis de confirmer la pr´esence des s´equences EST. Ce criblage a aussi d´emontr´e
que la banque utilis´ee ´etait peu couvrante pour les r´egions ´etudi´ees ne permettant pas le
regroupement en contig des clones BAC de sondes voisines chez la plante mod`ele. Par contre,
le regroupement des clones BAC positifs `a une mˆeme sonde montre qu’il existe plusieurs lo-
calisations pour cette sonde, conform´ement aux informations pr´ealables fournies par Synteny
Search. Parall`element aux hybridations, 51 s´equences EST ont servi de matrice `a la d´efinition
de couples d’amorces sp´ecifiques de r´egions conserv´ees de part et d’autre d’introns. L’amplifi-
cation par PCR sur diff´erents cultivars de tournesol pr´esente une efficacit´e de 90% et le taux
de polymorphisme de taille observ´e et v´erifi´e sur gel d’agarose est de 15%, ce qui a permis
d’int´egrer 7 nouveaux marqueurs mol´eculaires `a une carte g´en´etique issue de lign´ees recombi-
nantes (Rachid Al-chaarani et al., 2004). Ces 7 marqueurs ne sont pas li´es entre eux et n’ont
donc pas permis de d´efinir de conservation de synt´enie entre tournesol et Arabidopsis.
En conclusion, Iccare permet de facilement et rapidement traiter un grand nombre de
donn´ees, de transf´erer les informations structurelles des g`enes pour faciliter et optimiser la
d´efinition d’amorces et de sondes et d’interpr´eter les r´esultats exp´erimentaux a` l’aide de Syn-
teny Search. En revanche, l’organisation du g´enome du tournesol et la synt´enie existant avec
Arabidopsis n’ont paspuˆetre´evalu´ees clairement. Lesdonn´ees pr´eliminaires obtenueslaissent
`apenserquel’espace entre les g`enes du tournesolsemble proportionnela`la diff´erence detaille
observ´eeavecleg´enomed’Arabidopsis,expliquantainsiladifficult´ea`regrouperlesclonesBAC
en contig. Un mode d’´evolution du g´enome du tournesol possible est donc l’augmentation de
distance interg´enique pouvant ˆetre due a` des transposons et r´etrotransposons.
ivAbstract
The sunflower (Helianthus annuus L) is one of most cultivated oil-seed plant. His great
genome size makes difficult the studyof gene of interest (agronomic traits) especially that few
information about it are available. Others plants or crops have more technical an financial
means than for sunflower (physical map, massive genome and mRNA sequencing, duplica-
tion search, transposons...). In order to study the sunflower genome organization, we have
developped a new method based ont synteny conservation with the model plant Arabidopsis
thaliana. The transfert of gene information to the EST ou mRNA sequences of the sunflower
permits to optimize the sequence exploitation. My thesis works consist in developping a new
methology of massive analysis of sunflower sequences then test experimentally the results in
order to get new information about the genome organization of the sunflower and to estimate
the degree of synteny with the Arabidopsis genome.
The methodology leads to the creation of a web server called Iccare. This bioinformatic
tool permits to compare and analyse a high number of sequences from differents plants or
animals organisms with the coding sequences of gene from the model organism which is res-
pectively Homo sapiens for the animals and Arabidopsis thaliana for the plants. The results
are displayed according to the location of the genes on the chromosomes of the reference
organism. Genes structure information and sequence similarities are combined in a graphical
representation in order to optimize the sequence exploitation by designing primers or probes.
The Synteny Search web site (not finished yet) complete the Iccare web server, it permits
to search the relation existing between the Arabidopsis genes and those of the rice (synteny
conservation) and the relation between the genes within a genome (lonely genes, duplicated
genes or genes belonging to multigenic family). This tool allows the access the information
about the selected genes on Iccare in order to verify and interpret the experimental results
(amplified fragment number or hybrided BAC clones).
The Iccare web server had permit to select among 60,200 sunflower sequences, 20,691 se-
quences presenting similarities with 3,635 Arabidopsis genes. The genome organization of the
sunflower and the synteny conservation with Arabidopsis had been studied by using EST
sequences of the sunflower wich present some similarities to 195 genes located on the chro-
mosome 5 of the model plant. One hundred and fifty nine EST sequences had been used to
design Overgo probes in two differents regions of the fifth chromosome. These probes have
been screened on a BAC clones library and over 70% were efficient. PCR amplification on
forty BAC clones had confirmed the screening. The screening had also shown that the BACcloneslibraryislesscoveringthanexpectedinthestudiedregions.SomeBACcloneshadbeen
fingerprinted and contig had been made showing different location for some Overgo probes
according to the Synteny Search web site results. In addition to the screening, fifty one EST
sequences had been used to design primer couple on conserved exons regions on both sides of
an intron. PCR amplification on different sunflower cultivar with the primer couples presents
90% of efficiency and the size polymorphism rate on agarose is about 15%. Seven primer
couples are used as molecular marker and are assigned on a genetic map (Recombinant In-
breed Lines). These molecular markers are not linked and any syntenic blocks can be defined
between the sunflower genome and the Arabidopsis genome.
In conlusion, the Iccare web server permits to facilitate and accelerate the traitement of
high number data, to transfert structural information of genes in order to optimize the pri-
mer design and the probe design and to interpret experimental results aided by the Synteny
Search web site. In spite of these new tools, the genome organization of the sunflower and the
synteny conservation with the Arabidopsis genome are not elucidated. The preliminary data
leave with thoughts that space between the sunflower genes seems proportional to the diffe-
rente genomesize between thesunflower genome andtheArabidopsis genome. Thesedatacan
explain the difficulty to contig BAC clones. One evolution of the sunflower genome possibility
is the increase of intergenic length due to transposons and retrotransposons.
viRemerciements
Ce manuscrit est la conclusion de quatre longues ann´ees de travail qui ont vu l’aboutissement
de nombreuses choses (Matrix, le Seigneur des Anneaux, Star Wars, mais pas Harry Potter).
Je profite de cette page ou` tout m’est permis pour remercier toutes les personnes qui
m’ont support´e (dans tous les sens du terme) au laboratoire `a commencer par :
Gilbert Alibert et Michel Petitprez, les directeurs successifs du laboratoire BAP de l’ENSAT
qui m’ont accueilli. Laurent Gentzbittel, mon directeur principal de th`ese, pour son soutien
pour l’obtention de la bourse de th`ese, ses nombreux conseils, sa disponibilit´e et ses
encouragements durant ces quatre ann´ees de th`ese. Christian Bri`ere, mon co-directeur de
th`ese, pour son aide en informatique et la gestion du r´eseau.
Les membres du Jury, Philippe Leroy, Sa¨ıd Mouzeyar, Claude Chevalet, Thomas Faraut,
Christian Bri`ere et Laurent Gentzbittel, pour la correction de ce manuscrit et leur
participation `a la soutenance.
Thierry Liboz pour son aide sur pas mal de protocoles de manip. Franc¸oise Jardinaud et
Fabienne Vailleau pour nos discussions et pour mon appart’ (merci Fabienne). Cecilia
Tamborindeguy, C´ecile Ben et Tarek Hewezi pour votre aide, votre soutien et aussi parce
qu’on ´etait doctorant en mˆeme temps. Annie Perrault, euh..., Gentzbittel depuis peu,
toutes mes f´elicitations et merci pour nos nombreuses discussions pas toujours scientifiques
je l’admets. Cathy Giovannini, Marie-Jo Tavella, Philippe Anson et Patrick Bermudes pour
votre gentillesse, votre humour, votre disponibilit´e et votre aide pr´ecieuse pour tout ce qui
concerne la vie du labo. Sylvie Dev`eze pour ton aide dans la recherche bibliographique (mon
Dieu comment aurais-je fait sinon...). Toutes les personnes de phytopathologie.
Thomas Faraut, un grand grand merci, pour ton aide et ta patience dans ma formation “ sur
le tas ” a` la bioinformatique. J’ai eu beaucoup de plaisir a` travailler avec toi.
Je finirai par les meilleurs (Yes c’est nous...), c’est-`a-dire toutes les personnes qui ont
partag´e mon bureau (enfin notre bureau), C´ecile Donnadieu Tonon (qui m’a support´e, ou
plutˆot subi depuis le d´ebut), S´ebastien Moretti, Erwan David, Sophie Curneau, Emilie
Beaumont, Gil, et les derniers arriv´es ceux qui m’ont royalement “ vir´e ” j’accuse loulou,alias Julien Sarry, et chouchou, G´erald Salin.
Je tiens aussi `a remercier toutes les personnes avec qui j’ai donn´e des cours (TP, TD, cours)
et qui m’ont fait appr´ecier cette partie du travail qu’est l’enseignement (Daniel Sayag, Farid
Regad, Laurent Gentzbittel, Anne Bernadac, Jean Kallerhof, Thierry Huguet)
Merci aussi a` tous les stagiaires qui ont pass´e de courts moments au labo, je leur souhaite
une bonne continuation et merci pour les bons moments de d´etentes et de rigolades.
Un petit mot pour mon coach sportif, Damien Meyer, nouveau docteur qui m’a devanc´e de
peu (lacheur, t’aurais pu faire un effort en derni`ere ann´ee pour qu’on continue le squash...).
Je finirais (ben ouais, j’ai pas encore fini, quatre ans c’est long) en remerciant
tous les personnes qui m’ont support´e en dehors du labo :
Ma ch´erie, G´eraldine, qui a fait preuve de beaucoup de compr´ehension, de gentillesse et
d’amour durant ces quatre ans, et surtout les derniers mois de r´edaction. Fabrice, Ingrid,
C´ecile, Julien, Estelle, Sylvain, Cyril et Nicole pour les nombreux moments de d´elire surtout
pendant les premiers de l’an. Fabrice et Ingrid, de nouveau, pour la piscine et les
nombreuses soir´ee de d´etente. C´ecile et Julien pour les moments fort sympathiques de
guitare, et la super correction du “ phranc`e selon S´edrik”.
Un coucou aussi `a lool, fifi, Gwen, Terminator, je vous oublie pas.
Merci aussi `a mes parents et mes fr`eres.
Merci `a tous,
cette th`ese est un peu le r´esultat de chacun
(enfin beaucoup de moi, mais un peu de vous aussi).
Ces quatre ann´ees de th`ese ont ´et´e tr`es enrichissantes et j’en garderai un bon souvenir (sauf
la r´edaction, c’est vraiment chi...). J’esp`ere que mon travail servira `a d’autres ´equipes et je
souhaite bon courage `a tous ceux qui consid`ereront mes travaux comme une porte ouverte
vers de nouvelles aventures (Shreck 3, Spider-man 3, X-men 3, Harry potter...).
PS : j’ai failli oublier de remercier deux individus cl´es de ma th`ese : mon ordinateur au
bureau avec qui j’ai pass´e ´enormement de temps a` le tapoter, parfois le frapper ainsi que
mon ordinateur portable qui m’a permis de r´ediger cette th`ese sous le soleil de n’importe ou`.
PS du PS : Je remercie aussi le professeur Tournesol, enfin la plante Tournesol, et non c’est
pas parce que je vais porter le titre de Docteur que je serai le m´echant dans Tintin.
PS du PS du PS : Je remercie aussi toutes les personnesque j’ai oubli´e de citer, excusez-moi.
viiiTable des mati`eres
1 Introduction 1
1.1 Le Tournesol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 Des Tournesols et des Hommes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.2 Le Tournesol, Une Plante d’Int´erˆet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Revue Bibliographique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.1 Le G´enome du Tournesol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.2 Evolution des G´enomes et des G`enes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.2.3 Comparaison de G´enomes et Synt´enie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.3 Objectifs du Travail de Th`ese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2 Cr´eation d’Outils Bioinformatiques 35
2.1 Iccare : Optimiser l’Exploitation des S´equences EST . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.1.1 S´electionner les S´equences EST les plus Informatives . . . . . . . . . . . 35
2.1.2 Iccare, un Server Web Efficace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.1.3 Am´eliorations apport´ees `a Iccare depuis la Publication . . . . . . . . . . 47
2.1.4 R´esultats G´en´eraux chez les Plantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.2 Iccare par la Pratique : la RuBisCo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
2.2.1 La RuBisCo, une enzyme indispensable . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
2.2.2 La Rubisco selon Iccare : les r´egions non codantes . . . . . . . . . . . . 63
2.2.3 Informations compl´ementaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2.2.4 V´erification Exp´erimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
2.2.5 Discussions et Conclusions sur la Rubisco . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
2.3 Exploiter la Synt´enie d’autres Organismes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
2.3.1 Synteny Search, Rechercher la Synt´enie et les Duplications . . . . . . . 81
3 V´erification Exp´erimentale 86
3.1 S’appuyer sur le G´enome d’Arabidopsis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3.1.1 Transf´erer les informations du g´enome d’Arabidopsis `a celui du Tournesol 86
3.1.2 LeG´enomed’Arabidopsis est-ilHom´eologuesavecleG´enomeduTournesol 88
3.2 R´esultats exp´erimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.2.1 Marqueurs Mol´eculaires et Cartes G´en´etiques . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.2.2 Criblage de la Banque de Clones BAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.3 Discussion des R´esultats Exp´erimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
3.3.1 Iccare permet de d´efinir des Marqueurs Mol´eculaires Exploitables . . . . 1063.3.2 Iccare permet de d´efinir des Sondes Overgo Efficaces . . . . . . . . . . . 108
3.3.3 Organisation du G´enome du Tournesol et Synt´enie . . . . . . . . . . . . 112
4 Conclusion G´en´erale & Perspectives 116
5 Mat´eriels et M´ethodes 120
5.1 Analyse de la Rubisco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
5.2 Criblage de la banque de clones BAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
5.2.1 Mat´eriels & M´ethodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
5.3 Tester les amorces et D´efinition de Cartes G´en´etiques . . . . . . . . . . . . . . 127
5.3.1 Mat´eriels & M´ethodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
A Erreurs de S´equenc¸age 149
B Du G`ene a` la Prot´eine 151
C The Iccare Web Server 154
D Multalin pour Iccare 161
E Filtres Haute Densit´e de la Banque de Clones BAC 164
F R´esultats des Hybridations des sondes Overgo 167
G Carte G´en´etique du Tournesol 170
H Migration sur Gel d’Agarose 4% 172
I R´esultats de l’analyse de MapMaker 175
J Comparatif : G`enes Similaires d’Arabidopsis et R´esultats Exp´erimentaux 186
K Extraction d’ADN G´enomique 187
L La Technique de SSCP 188
M Miniprep 190
N S´equences des Sondes Overgo 191
O D´efinition des sondes Overgo multi 194
P Pattern de d´epoˆt des clones BAC positifs 196
Q Extraction d’ADN de Clone BAC 198
R S´equences des Couples d’Amorces 199
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