A homogenous fluorescence assay of micro RNA maturation [Elektronische Ressource] / von Brian Patrick Davies
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A Homogenous Fluorescence Assay of micro RNA Maturation Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) im Fach Chemie eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin von Dipl.-Chem. Brian Patrick Davies geboren am 22.05.1975 in Wilmington, Delaware USA Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. Christoph Markschies Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Christian Limberg Gutachter: 1. Prof. Dr. Christoph Arenz 2. Prof. Dr. Sabine Müller 3. Prof. Dr. Oliver Seitz Tag der mündlichen Prüfung: 17. Juni, 2008 i Abstract Micro RNAs (miRNAs) are non-coding double-stranded RNAs ~22 nucleotides long that play a vital role in development and regulation in nearly all eukaryotes. Through non-perfect hybridization to complementary sequences in the 3 ′-untranslated regions of mRNA protein translation is inhibited, leading to downregulation of the respective protein(s). Many diseases have been found to be influenced, if not caused (oncogenetic miRNAs) by aberrant expression of miRNAs. Thus, a manipulation of miRNA formation may have therapeutic potential. The miRNAs are cleaved from longer hairpin precursor RNA (pre-miRNA) in the cytoplasm by the enzyme Dicer. It might be possible to inhibit this enzymatic cleavage through specific pre-miRNA binding molecules, for example.

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Publié le 01 janvier 2008
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Langue English
Poids de l'ouvrage 6 Mo

Extrait


A Homogenous Fluorescence Assay of micro RNA Maturation
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Chemie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dipl.-Chem. Brian Patrick Davies
geboren am 22.05.1975 in Wilmington, Delaware USA

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Christian Limberg

Gutachter: 1. Prof. Dr. Christoph Arenz
2. Prof. Dr. Sabine Müller
3. Prof. Dr. Oliver Seitz
Tag der mündlichen Prüfung: 17. Juni, 2008 i
Abstract
Micro RNAs (miRNAs) are non-coding double-stranded RNAs ~22 nucleotides long that play
a vital role in development and regulation in nearly all eukaryotes. Through non-perfect
hybridization to complementary sequences in the 3 ′-untranslated regions of mRNA protein
translation is inhibited, leading to downregulation of the respective protein(s). Many diseases
have been found to be influenced, if not caused (oncogenetic miRNAs) by aberrant expression
of miRNAs. Thus, a manipulation of miRNA formation may have therapeutic potential.
The miRNAs are cleaved from longer hairpin precursor RNA (pre-miRNA) in the cytoplasm
by the enzyme Dicer. It might be possible to inhibit this enzymatic cleavage through specific
pre-miRNA binding molecules, for example. Many compounds are known that bind RNA
with high affinity such as aminoglycosides, proteins, peptides, and even other RNAs.
Therefore, the search for selective binders of pre-miRNA and thus inhibitors of miRNA
maturation begins with the synthesis and testing of large libraries of substances, best done
using high throughput screening (HTS).
This work describes the first homogenous assay of miRNA maturation. The assay is based on
a fluorescent probe in the form of a pre-miRNA containing a 5 ′-fluorophore (FAM, Cy3, or
TMR) and a 3 ′-quencher (DABCYL). This pre-miRNA ‘beacon’ in its native hairpin
formation brings the fluorophore and quencher moieties into close proximity, resulting in
fluorescence quenching. Dicer enzyme is able to efficiently cleave this structure leading to
dissociation of fluorophore and quencher and thus a concentration- and time-dependent
fluorescence increase. In the presence of an RNA ligand that blocks Dicer from cleaving, a
lower or no fluorescence increase is observed. The assay has been optimized for screening in
384-well microtiter plates using a plate reader so that HTS should be possible.
The first compounds were tested for their inhibition of pre-miRNA maturation by Dicer.
Using a duplex assay with two different pre-miRNA probes each containing a different
fluorogenic group (FAM or TMR) some specific inhibition could be shown. Additionally, the
assay was performed in HEK 293 cells using fluorescence microscopy to detect the
fluorescence increase. This would allow a cell-based screening of potential inhibitors.
In contrast to the first-generation pre-miRNA probes, which were made via semi-automated
chemical RNA synthesis together with enzymatic ligation, an alternative approach using in
vitro transcription followed by enzymatic ligation was established. Using various fluorophores
and/or quenchers it should be possible to make a variety of beacons quickly and easily in large ii
amounts needed for HTS. Further development of the assay as well as synthesis and testing of
compound libraries may lead to the discovery of highly selective inhibitors of pre-miRNA
maturation and thus disease therapeutics.


Keywords:
miRNA, fluorescence assay, RNA binders, miRNA maturation inhibition iii
Zusammenfassung
Micro RNA (RNA = Ribonukleinsäuren) sind nicht-kodierende doppelsträngige RNA ~22
Nukleotiden lang, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Regulation in beinahe allen
Eukaryoten spielen. Durch unvollständige Hybridisierung mit komplementären Sequenzen im
3′-nicht-translatierten Bereich der mRNA wird die Proteintranslation inhibiert, was zu einer
Herunterregulation des entsprechenden Proteins führt. Viele Krankheiten sind bekannt, die
durch veränderte miRNA Expressionsmuster entweder beeinflusst oder sogar verursacht
(onkogenetische miRNA) werden. Demnach könnte eine Manipulation der miRNA-Bildung
einen therapeutischen Ansatz darstellen.
Die miRNA werden im Zytoplasma von längeren haarnadelförmigen prekursor RNA
Strukturen (pre-miRNA) durch das Enzym Dicer freigsetzt. Inhibition dieser enzymatischen
Spaltung könnte zum Beispiel durch spezifische pre-miRNA-bindende Moleküle erfolgen. Es
sind viele Verbindungen bekannt die mit hoher Affinität RNA binden, wie Aminoglykoside,
Proteine, Peptide und sogar andere RNA. Daher beginnt die Suche nach selektiven pre-
miRNA Bindern und Inhibitoren der miRNA-Reifung mit der Synthese und dem Testen von
großen Bibliotheken verschiedener Verbindungen bestenfalls durch Hochdurchsatzscreening.
Die vorliegende Arbeit beschreibt den ersten homogenen Assay der miRNA-Reifung. Der
Assay basiert auf einer Fluoreszenzsonde in Form einer pre-miRNA, die einen 5 ′-Fluorophor
(FAM, Cy3, oder TMR) und einen 3 ′-Quencher (DABCYL) aufweist. Durch die unmittelbare
Nachbarschaft von Fluorophor und Quencher in der nativen Haarnadelstruktur der pre-
miRNA-Sonde erfolgt Fluoreszenzlöschung. Das Enzym Dicer ist in der Lage diese Struktur
effizient zu spalten, was wiederrum zur Dissoziation von Fluorophor und Quencher und somit
zu einem konzentrations- und zeitabhängigen Fluoreszenzanstieg führt. Der Assay wurde in
384-Well Mikrotiterplatten optimiert, sodass ein Hochdurchsatzscreening möglich sein sollte.
Die ersten Verbindungen wurden mit dem Assay auf deren Inhibition der miRNA-Reifung
bereits getestet. Unter Verwendung eines Duplexassays, wobei zwei unterschiedliche pre-
miRNA Sonden mit verschiedenen Fluorophoren (FAM oder TMR) eingesetzt wurden, konnte
etwas Spezifizität der Inhibition gezeigt werden. Außerdem wurde der Assay in HEK 293
Zellen durchgeführt, wobei der Fluoreszenzanstieg mit Fluoreszenzmikroskopie detektiert
wurde. Somit ist ein Zell-basiertes Screening von potenziellen Inhibitoren möglich.
Im Gegensatz zur ersten Generation von Sonden, die über semi-automatisierte chemische
RNA-Synthese zusammen mit enzymatischer Ligation hergestellet wurden, konnte eine iv
alternative Syntheseroute mit in vitro Transkription und anschließender enzymatischen
Ligation entwickelt werden. Die Diversität der benötigten Sonden für ein
Hochdurchsatzscreening kann durch den Einsatz unterschiedlicher Fluorophore und/oder
Quencher bei der Sondenherstellung erreicht werden. Eine weitere Entwicklung des Assays,
zusammen mit der Untersuchung von Substanzbibliotheken, sollte zu hoch selectiven
Inhibitoren der pre-miRNA-Reifung und dadurch zu therapeutischen Ansätzen führen.

Schlagwörter:
miRNA, Fluoreszenzassay, RNA Binder, miRNA Reifung Inhibition v
Table of Contents
Abstract ...................................................................................................................................... i
Zusammenfassung...................................................................................................................iii
Abbreviations.......................................................................................................................... vii
1 Introduction........................................................................................................................ 1
1.1 miRNA, siRNA and RNA Interference ........................................................................ 1
1.2 Dicer...........................................................................................................................4
1.3 miRNA Function and Disease .................................................................................... 5
1.4 Therapeutic Possibilities in RNAi Pathways.............................................................. 7
1.4.1 siRNA and Antisense miRNA ‘Antagomirs’.......................................................... 7
1.4.2 Small Molecules, Peptides, and Aptamers as RNA Binders .................................. 8
1.5 Inhibition of miRNA Maturation as a Therapeutic Concept .................................... 12
2 Objectives ......................................................................................................................... 14
3 Results and Discussion .................................................................................................... 16
3.1 Synthesis of Labeled miRNA Maturation Probe....................................................... 16
3.1.1 Chemical Synthesis of RNA Strands.................................................................... 16
3.1.2 Beacon Formation via Ligation with T4 RNA Ligase.......................................... 20
3.2 Assay Development................................................................................................... 23
3.3 Inhibitors of miRNA Maturation .........................................................................

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