A role for Sum1 in HML silencing and replication initiation in Saccharomyces cerevisiae [Elektronische Ressource] / von Horst Irlbacher

Irlbach

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2005
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• Langue: Deutsch
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Extrait

A role for Sum1 in HML silencing and replication initiation in
Saccharomyces cerevisiae


DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)


im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologe
Horst Irlbacher
geb. 11.05.1971 in Schwandorf/Bay.


Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter/-innen: 1. Prof. Dr. Harald Saumweber
2. Prof. Dr. Ann Ehrenhofer-Murray
3. Prof. Dr. Jörn Walter
Tag der mündlichen Prüfung: 14.07.2005
Zusammenfassung


Zusammenfassung

In der eukaryotischen Ontogenese ist die Etablierung differenzierungsspezifischer
Genexpression eng an die Unterteilung des Genoms in funktionell getrennte Domänen
gekoppelt. Solche Domänen lassen entweder erhöhte transkriptionelle Aktivität zu oder
unterdrücken sie und werden Eu- bzw. Heterochromatin genannt. Heterochromatin enthält
spezielle Proteine, die zur Ausbildung dieser repressiven Chromatinstruktur beitragen. Eine
der Hauptfragen in der Heterochromatinbiologie ist, wie solche Proteine rekrutiert werden.
Dieser Prozess ist entscheidend damit einzelnde Regionen im Genom koordiniert zeit- und
ortsabhängig reprimiert werden können. In Saccharomyces cerevisiae entsteht Hetero-
chromatin an den silent-mating-type Loci HMRa und HMLα durch die zielgerichtete
Rekrutierung des Sir-Komplexes über eine Gruppe von Proteinen, die an sogenannte silencer-
DNA Sequenzen binden. In diese Arbeit wird gezeigt, daß das Protein Sum1, bisher bekannt
als Repressor meiotischer Gene im vegetativen Zellzyklus, als Heterochromatin-
Rekrutierungsfaktor für HMLα fungiert. Sum1 konnte in vitro und in vivo an HMLα über ein
funktionelles Element innerhalb des HML-E silencers binden und die Deletion von SUM1
verursachte einen Verlust von Repression an HMLα.
SUM1 beeinflußte außerdem die Fähigkeit von HML-E als Replikationsstartpunkt (origin) zu
agieren, was eine Rolle von Sum1 in der Replikation nahelegt. Die Beobachtung, daß orc2-1
und orc5-1 mit sum1∆ synthetisch lethal waren und daß cdc6-1, cdc7-1 oder cdc45-1 mit
sum1∆ einen synthetischen Wachstumsdefekt aufwiesen unterstützt die Vermutung, daß
SUM1 eine globale Rolle in der Replikationsinitiation besitzt. In einer genomweiten Suche
wurden ARS Elemente gefunden, die sowohl Sum1 als auch ORC rekrutieren. Dabei konnte
gezeigt werden, daß die Replikationsaktivität dieser ARS Elemente von Sum1 bzw. Sum1
Bindungsstellen abhängig war. Als Repressor von meiosespezifischen Genen interagiert
Sum1 oft mit der Histondeacetylase Hst1. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden,
daß SUM1-regulierte origins ebenfalls HST1 zur vollen Aktivität benötigten.
Zusammenfassend schlagen wir Sum1 als neuartigen Modulator für die Replikationsinitiation
an einer Untergruppe chromosomaler Replikationsstartpunkte vor.
Schlagworte:
Chromatin, Silencing, Replikationsstartpunkt, Replikation, ARS, Sum1, Hst1
Abstract



Abstract

The division of eukaryotic chromatin into functionally distinct domains is critical to
implement gene expression programs that drive the development of multicellular organisms.
Regions termed euchromatin exist in the genome that are generally conducive to transcription,
whereas heterochromatin contains specialized chromatin binding proteins that repress
transcription in these regions. A central question in heterochromatin biology is how the
heterochromatin factors are targeted to specific genomic regions, a process that is crucial to
ensure that the designated domains, and only they, are repressed in the appropriate spatial and
temporal fashion. In Saccharomyces cerevisiae heterochromatinization at the silent mating-
type loci HMRa and HMLα is achieved by targeting the Sir complex to these regions via a set
of anchor proteins that bind to the silencers. Here, we have identified a novel heterochromatin
targeting factor for HMLα, the protein Sum1, a repressor of meiotic genes during vegetative
growth. Sum1 bound both in vitro and in vivo to HMLα via a functional element within the
HML-E silencer, and deletion of SUM1 caused HMLα derepression. Significantly SUM1 was
also required for origin activity of HML-E, suggesting a role of Sum1 in replication initiation.
Our observations of a synthetic lethality between orc2-1 or orc5-1 and sum1∆ as well as a
synthetic growth defect of cdc6-1, cdc7-1 and cdc45-1 with sum1∆ support the notion that
SUM1 has a global role in replication initiation. In a genome-wide search for Sum1-regulated
origins, we identified a set of autonomous replicative sequences (ARS elements) that bound
both the origin recognition complex and Sum1. Full initiation activity of these origins
required Sum1, and their origin activity was decreased upon removal of the Sum1 binding
site. In its role as a repressor of meiosis specific genes, Sum1 often works in concert with the
histone deacetylase Hst1. We found that SUM1-regulated origins also required HST1 for full
activity. Taken together we propose that Sum1 is a novel replication initiation modulator for a
subset of chromosomal origins.
Keywords:
Chromatin, silencing, origin, replication, ARS, Sum1, Hst1
Contents

Contents

1 Introduction ...................................................................................................................... 3
1.1 Epigenetics and regulation of gene expression .......................................................... 3
1.2 Chromatin and gene expression ................................................................................. 4
1.3 Chromatin composition.............................................................................................. 5
1.4 Mechanisms that alter chromatin properties .............................................................. 6
1.4.1 Chromatin remodeling............................................................................................ 6
1.4.2 atin modifications........................................................................................ 7
1.5 Silencing in Saccharomyces cerevisiae...................................................................... 9
1.5.1 Silencing at the HM loci....................................................................................... 10
1.5.2 ing at the telomeres and the rDNA locus ................................................... 13
1.6 Replication initiation................................................................................................ 14
1.6.1 Origins of replication ........................................................................................... 15
1.6.2 Events during replication initiation 17
1.7 Regulation of replication initiation .......................................................................... 19
1.8 Proteins investigated in this work ............................................................................ 22
1.8.1 Sum1..................................................................................................................... 22
1.8.2 Hst1 and Rfm1 ..................................................................................................... 25
1.9 Outline of this thesis................................................................................................. 27
2 Materials and Methods .................................................................................................. 29
2.1 E.coli strains............................................................................................................. 29
2.2 Growth conditions and media .................................................................................. 29
2.3 Yeast strain construction .......................................................................................... 29
2.4 Yeast strains 30
2.5 Plasmid construction ................................................................................................ 32
2.6 Silencing assays........................................................................................................ 34
2.7 Plasmid loss assay .................................................................................................... 34
2.8 Yeast extracts for Western blotting.......................................................................... 35
2.9 SDS PAGE and Immunoblotting ............................................................................. 35
2.10 Co-Immunoprecipitation ...................................................................