Analysis of molecular events involved in chondrogenesis and somitogenesis by global gene expression profiling [Elektronische Ressource] / Matthias Wahl

Sujets

• Gesundheit

Informations

• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2004
• Nombre de lectures: 17
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Technische Universit at Munc hen
GSF-Forschungszentrum Neuherberg
Analysis of Molecular Events Involved in
Chondrogenesis and Somitogenesis by Global
Gene Expression Pro ling
Matthias Wahl
Vollst andiger Abdruck der von der Fakult at Wissenschaftszentrum Weihen-
stephan fur Ern ahrung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Univer-
sit at Munc hen zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. A. Gierl
Prufer der Dissertation: 1. Hon.-Prof. Dr. R. Balling, Technische Uni-
versit at Carlo-Wilhelmina zu Braunschweig
2. Univ.-Prof. Dr. W. Wurst
Die Dissertation wurde am 29. Oktober 2003 bei der Technischen Univer-
sit at Munc hen eingereicht und durch die Fakult at Wissenschaftszentrum Wei-
henstephan fur Ern ahrung, Landnutzung und Umwelt am 14. Januar 2004
angenommen.iiZusammenfassung
Um die molekularen Mechanismen, welche Knorpelentwicklung und Somito-
genese steuern, aufzukl aren, wurde eine globale quantitative Genexpressions-
analyse unter Verwendung von SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) an
der knorpelbildenden Zelllinie ATDC5 und an somitischem Gewebe, pr apariert
von E10.5 M ausen, durchgefuhrt.
Unter insgesamt 43,656 von der murinen knorpelbildenden Zelllinie ATDC5
gewonnenen SAGE Tags (21,875 aus uninduzierten Zellen und 21,781 aus
Zellen, die fur 6h mit BMP4 induziert wurden) waren 139 Transkripte un-
terschiedlich in den beiden Bibliotheken repr asentiert (P 0.05). 95 Tags
konnten einzelnen UniGene Eintr agen zugeordnet werden (77 bekannte Gene
und 18 ESTs), aber ub erraschenderweise wurden viele davon bisher nicht mit
der Di erenzierung von Knorpel in Verbindung gebracht. Interessanterweise
wurde von einer signi k anten Fraktion dieser Gene Gruppen physikalischer
Verknupfung gebildet.
Fur die Untersuchung der Somitogenese wurden Expressionspro le von
vier verschiedenen Teilen des caudalen bereiches von E10.5 Maus Embry-
onen verglichen: Schwanzknospe (A), die caudalen zwei Drittel (B) und das
rostrale Drittel (C) des pr asomitischen Mesoderms und zwei Paare werden-
der Somiten. Insgesamt wurden 171,639 LongSAGE Tags (A: 21,595; B:
50,699; C: 49,732; D: 49,613) generiert, wodurch 1007 Transcripte identi-
ziert wurden, welche zumindest zwischen zwei Bibliotheken unterschiedlich
repr asentiert waren (P 0.05).
Alle LongSAGE Tags, die mindestens zwei Mal in dem gesamten Daten-
satz vorkamen, wurden mit der momentanen EnsEMBL Genom- Annotierung
verglichen. Die Analyse von LongSAGE Tags ohne entsprechendem En-
sEMBL Gen fuhrte zur Identi k ation von 1872 Gene, welche bisher noch
nicht an das Genom annotiert wurden, aber durch einen UniGene Cluster
repr asentiert sind. Zus atzlich konnten 2348 GeneScan Vorhersagen veri ziert
und 547 Antisense- Gene identi ziert werden.
Eine Analyse von o en tlich zug anglichen SAGE Bibliotheken zeigte, dass
Zielgene von anderen Signaltransduktionswegen als BMP4 auch Cluster imiv
Genom bilden. Desweiteren wurden die beobachteten Ver anderungen in
der Genexpression von ribosomalen Proteinen in verschiedenen Geweben
unter unterschiedlichen Bedingungen untersucht. Erstaunlicherweise zeigte
eine Cluster- Analyse, dass verschiedene Gewebetypen eindeutig abgegrenzte
Genexpressionspro le ribosomaler Proteine haben.
Zusammenfassend bietet die Transkriptiom- Analyse von BMP- induzierter
Knorpelentwicklung sowie Somitogenese einen Einblick auf die molekularen
Ereignisse, welche beide Entwicklungsprozesse steuern. Generell sind mehrere
Signaltransduktionswege sowie eine vielzahl zellul arer Prozesse involviert.
Weitere Studien werden zeigen, wie diese Ver anderungen in der Genexpres-
sion hervorgerufen werden und wie sie in die fein abgestimmten zellul aren
Ereignisse von Knorpel- und Somitenentwicklung organisiert werden.Summary
In order to better understand the molecular mechanisms that control chon-
drogenesis and somitogenesis, a global quantitative expression pro ling using
SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) was performed on a chondrogenic
cell line, ATDC5, and on somitic tissues dissected from mouse E10.5 embryos.
Among a total of 43,656 SAGE tags derived from mouse c
ATDC5 cells (21,875 from uninduced cells and 21,781 from cells induced
with BMP4 for 6 h), 139 transcripts were di eren tially represented in the two
libraries (P 0.05). Ninety- v e of them matched to single UniGene entries
(77 known genes and 18 ESTs), but surprisingly, many of them have never
been implicated in chondrogenic di eren tiation. Interestingly, a signi can t
fraction of these genes formed physical linkage groups.
For the study of somitogenesis, the expression pro les in four di eren t
subsets of the caudal part of E10.5 embryos was compared: The tail bud
(A), the caudal 2/3 (B) and the rostral 1/3 (C) of the presomitic mesoderm,
and two pairs of nascent somites (D). A total of 171,639 LongSAGE tags
(A: 21,595; B: 50,699; C: 49,732; D: 49,613) were generated leading to the
identi cation of 1007 transcripts di eren tially represented between at least
two of the libraries (P 0.05).
The LongSAGE tags with a count of two or more were compared against
the current genome annotation of EnsEMBL. The analysis of LongSAGE
tags with no corresponding EnsEMBL gene lead to the identi cation of 1872
genes, that were not yet annotated to the genome, but represented by a
UniGene cluster. Furthermore, 2348 GeneScan predictions could be veri ed
with LongSAGE tags and 547 antisense genes were identi ed.
A analysis of publically available SAGE libraries showed that target genes
of signaling pathways other than BMP also cluster to the genome. Further-
more, the observed changes in the expression of ribosomal protein genes
in various tissues under di eren t conditions were examined. Surprisingly,
cluster analysis showed that di eren t tissue types had distinct pro les of
ribosomal protein gene expression.
In conclusion, the transcriptome analyses of both BMP-induced chondro-vi
genesis and somitogenesis provided an insight on the molecular events during
both developmental processes. In general, multiple signaling pathways and
a variety of cellular processes are involved. Further study will clarify how
these changes in gene expression are brought about and are organized into
the concerted cellular events of chondrogenic and somitogenic di eren tiation.Acknowledgements
I would like to thank:
Prof. Rudi Balling, doctoral advisor and mentor of my thesis
for his strong support even after he moved to Braunschweig.
Dr. Kenji Imai, supervisor of my thesis
for giving me the chance to develop my projects in my own responsi-
bility, for fruitful discussions and huge advice, and for the contribution
1to my work .
Dr. Chisa Shukunami, collaborator and host (Feb. till April, 2001)
2for the contribution to my work and for her great hospitality during
my stay in her lab in Kyoto.
Dr. Ulrich Heinzmann, collaborator
1for the contribution to my work , for valuable advise and for the inter-
esting discussions during lunch.
all the people from my work group and from other groups of the Insti-
tute of Developmental Genetics and Institute of Experimental Genetics
at the GSF (expecially all the people who ever participated in our joint
lab-meetings) for very constructive interactions and a friendly atmo-
sphere.
and all the members of the Department of Molecular Interaction and
Tissue Engineering at the University of Kyoto for their help and advice,
and for making my life in Japan very easy.
1especially for the participation in the dissection of the somitic tissue (3.3.1).
2pilot study for ATDC5 (3.2.1) and majority of northern blots in 3.2.5.3.viiiContents
1 Introduction 1
1.1 Chondrogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Somitogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2 Materials and methods 11
2.1 Molecular biology methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.1 RNA extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.2 Cycle sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.3 Cell culture of ATDC5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.4 Serial analysis of gene expression . . . . . . . . . . . . 12
2.1.5 GLGI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.1.6 Probes used for northern blot analysis and whole mount
in situ hybridization (ATDC5) . . . . . . . . . . . . . . 12
2.1.7 Northern blot analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.1.8 Quantitative real-time PCR . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.1.9 Whole mount in situ hybridization . . . . . . . . . . . 14
2.2 Methods for experimentation on animals . . . . . . . . . . . . 14
2.2.1 Preparation of mouse embryos . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2.2 Microdissection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3 Data processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3.1 SAGE tag assignment . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3.2 Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3.3 Virtual subtraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3.4 Link of mouse SAGE tags Mouse Genome Informatics . 18
2.3.5 automated annotation of LongSAGE tags . . . . . . . 19
2.3.6 Chromosomal localization of di eren tially expressed SAGE
tags . . . . .