Analysis of parasite-specific T cells and cellular interactions in the spleen during Plasmodium berghei induced experimental cerebral malaria [Elektronische Ressource] / Kim Ellen Schmidt. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
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Analysis of parasite-specific T cells and cellular interactions in the spleen during Plasmodium berghei induced experimental cerebral malaria [Elektronische Ressource] / Kim Ellen Schmidt. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät

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Analysis of parasite-specific T cells andcellular interactions in the spleenduringPlasmodiumberghei inducedexperimental cerebral malariaDissertationzurErlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)derMathematisch-Naturwissenschaftlichen FakultätderRheinischen Friedrich-Whilhelms-Universität BonnKim Ellen SchmidtausFilderstadtBonn2011Angefertigt mit der Genehmigung der Mathematisch-NaturwissenschaftlichenFakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn1. Gutachter: Prof. Dr. med. Achim Hörauf2. Prof. Dr. Norbert KochTag der mündlichen Prüfung: 21. Oktober 2011Erscheinungsjahr: 2011Diese Dissertation ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB Bonnhttp://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online elektronisch publiziert.iDiese Arbeit wurde von Feburar 2007 bis April 2011 am Institut für medizinischeMikrobiologie, Immunologie und Parasitologie unter der Leitung von Professor Dr.Achim Hörauf angefertigt.Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne fremdeHilfe verfasst habe. Andere als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel wurdennicht benutzt und wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen der angegebenenWerke sind als solche kenntlich gemacht. Ferner versichere ich, dass ich diese Dis-sertation an keiner anderen Universität eingereicht habe, um ein Promotionsver-fahren eröffnen zu lassen.iiAbstractVector-transmitted parasitic infections are a global health problem.

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Publié le 01 janvier 2011
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Analysis of parasite-specific T cells and cellular interactions in the spleen duringPlasmodium bergheiinduced experimental cerebral malaria
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Rheinischen Friedrich-Whilhelms-Universität Bonn
Kim Ellen Schmidt aus Filderstadt
Bonn
2011
Angefertigt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
1. Gutachter:
2. Gutachter:
Prof. Dr. med. Achim Hörauf
Prof. Dr. Norbert Koch
Tag der mündlichen Prüfung: 21. Oktober 2011
Erscheinungsjahr: 2011
Diese Dissertation ist auf dem Hochschulschriftenserver der ULB Bonn http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online elektronisch publiziert.
i
Diese Arbeit wurde von Feburar 2007 bis April 2011 am Institut für medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie unter der Leitung von Professor Dr. Achim Hörauf angefertigt.
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe. Andere als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel wurden nicht benutzt und wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen der angegebenen Werke sind als solche kenntlich gemacht. Ferner versichere ich, dass ich diese Dis-sertation an keiner anderen Universität eingereicht habe, um ein Promotionsver-fahren eröffnen zu lassen.
ii
Abstract
Vector-transmitted parasitic infections are a global health problem. Diseases such as malaria are a major health threat and economic burden for developing coun-tries. In Sub-Saharan Africa malaria causingPlasmodiumparasites may evoke life threatening complications, which mainly affect children under the age of five years. Pathogenesis of cerebral malaria is a multifactorial complex process that involves inflammatory mediators such as effector T cells and IFN-γ origin and cel-. Time, lular and molecular factors involved in early immune responses priming effector T cells responsible for the pathogenesis of cerebral malaria have been less investi-gated. In our study we were able to determine the presence of parasite specific cy-totoxic T cells in spleen and brain duringPlasmodium bergheiinfection. This enabled us to analyse cellular interactions involved in the priming of T cells directed against the parasite. The place of essential T cell priming duringPlasmodiuminfections was determined in splenectomised mice, in which effector responses were reduced and experimental cerebral malaria (ECM) pathology was absent. Depletion of antigen-presenting cells, involved in maintaining the organized splenic structure, abro-gated T cell priming and resulted in the loss of effector responses. Without either macrophages, DCs or B cells lytic activity and IFN-γproduction by parasite-specific T cells was diminished and in the absence of effector responses ECM progression was suppressed. In detail, we provide evidence that macrophages, B cells and den-dritic cells, as well as CD4+T cells together with TLR-9 and IL-12 signalling com-prise complex interactions affecting T cell generation during blood stage malaria leading to neuropathology.
Taken together our study suggests, that early immune responses duringP. berghei infection are generated in the spleen and that distinct cells and cytokines drive gen-eration of parasite-specific T cells leading to subsequent pathology.
iii
Abstrakt
Durch Vektoren übertragene Parasiteninfektionen stellen weltweit eine große Her-ausforderung dar. Krankheiten, wie z.B. Malaria bergen große gesundheitliche, aber auch ökonomische Risiken. Malaria, ausgelöst durch einePlasmodium-Infektion, ist eine schwerwiegende Krankheit mit zum Teil lebensgefährlichen Kom-plikationen, die insbesondere Kinder unter fünf Jahren betreffen. Die Pathogenese von zerebraler Malaria ist ein multifaktorieller und komplexer Entzündungs-prozess, bei dem Effektor T-Zellen und IFN-γeine wichtige Rolle spielen. Obwohl T-Zellen stark in die Entwicklung zerebraler Malaria involviert sind, ist über Ur-sprung, zeitliche Abfolge und zelluläre und molekulare Prozesse der frühen Immu-nantwort, die für die Aktivierung von Effektor T-Zellen verantwortlich sind, bisher wenig bekannt. Wir konnten die Existenz von Parasiten-spezifischen zytotoxis-chen T-zellen in der Milz und im Gehirn während einerPlasmodium bergheiANKA Infektion in einem Mausmodell nachweisen. Das Entfernen der Milz ging mit einem reduziertem Risiko der zerebrale Malaria und einer verminderten Entzün-dungsreaktion einher. Dies zeigte, dass Effektor T-Zellen in der Milz generiert wer-den. Durch die Depletion Antigen-präsentierender Zellen, welche strukturgebend für die Milzarchitektur sind, wurde die Generierung und Aktivierung von Effek-tor T-Zellen verhindert und inflammatorische Reaktionen unterbunden. In Abwe-senheit von Makrophagen, dendritischen Zellen, oder B-Zellen war die zytotoxis-che Aktivität und die INF-γAntwort reduziert und neuropathologische Symptome blieben aus. Dies deutet darauf hin, dass komplexe Interaktionen von Makropha-gen, B-Zellen, und dendritische Zellen, sowie CD4+T Helfer Zellen zusammen mit TLR-9 und IL-12 Signalwegen, die T-Zell-Generierung in einerPlasmodium-Infektion und somit die Pathogenese von zerebraler Malaria stark beeinflussen. Zusammengefasst liefert dieses Projekt Hinweise dafür, dass die frühe Immunant-wort gegen den Parasiten in der Milz hervorgerufen wird, wobei spezifisch Immun-zellen und Zytokine an der Bildung von Effektor T-Zellen beteiligt sind, welche wiederum zu der Entstehung von neurologischen Schäden führen.
iv
List
of
α AdOVA Ag APC AT BBB BMDC BSA CD CloLip CM CTL DC DOG dpi DTR DTX ECM EDTA ELISA FACS FITC GPI i.p. i.v. ICAM
Abbreviations
List of Abbreviations
anti-recombinantAdenovirustype 5 expressing ovalbumin antigen antigen-presenting cell autotransplantation blood-brain barrier bone marrow derived dendritic cell bovine serum albumine
cluster of differentiation clodronate liposome cerebral malaria cytotoxic T lymphocyte dendritic cell
CD11c DTR Ovalbumin green fluorescent protein days post infection
diphtheria Toxin Receptor diphtheria Toxin experimental cerebral malaria Ethylenediaminetetraacetic acid enzyme linked immuno sorbent assay fluorescence activated cell sorter fluorescein glycosyl-phosphatidyl-inositol intraperitoneal intravenous intercellular adhesion molecule; CD54
v
IDO IFN Ig IL iRBC KO LPS LT mAb MHC mM MMM MSP MZ MZM NfκB µg ng NK NKT NO ODN OVA p.i. PALS PAMP PbA PBS PbTG PRR RAG RBC rpm RT
indoleamine 2,3-dioxygenase interferon immune globuline interleukin infected red blood cell knock-out lipopolysaccharide lymphotoxin monoclonal antibody major histocompatibility complex millimolar
List of Abbreviations
metallophillic marginal zone macrophage merozoite surface protein marginal zone
marginal zone macrophage nuclear factor kappa B microgram nanogram natural killer natural killer T cell nitric oxide
oligodeoxynucleotide ovalbumin post infection periarteriolar lymphoid sheath pathogen associated molecular pattern Plasmodium bergheiANKA phosphate buffered saline recombinantPlasmodium bergheiexpressing ovalbumin pattern recognition receptor recombinant activation gene deficient mice red blood cell
rotations per minute room temperature
vi
S8L SCID mice SNP SplX TCR Th TLR TNF
List of Abbreviations
SIINFEKL, OVA-derived MHC class I peptide nude severe combined immunodeficient mice single nucleotide polymorphism splenectomy T cell receptor T helper Toll-like receptor tumour necrosis factor
vii
Contents
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16
16
20
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20
16
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20
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modium bergheiMSP-1 . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Identification of H-2kb and H-2db specific peptides fromPlas-
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2
Material and Methods
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2.1
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2.2.2
Experimental animal handling and knock-out mice
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and Objectives .
Aims
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Animal maintenance . . . .
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Material . . . . . . .
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Equipment . . . . . . . . . . . . .
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2.1.3
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2.1.2
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order
Buffers and solutions in alphabetical
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2.2.1
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Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Computer software . . . . . . . .
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Rodent model of cerebral malaria . . . . . . . . . . . . . . . .
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The spleen . . . . . . . . . . . . .
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Antigen-presentign cells (APCs)
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1.2.4
Toll-like receptors . . . . . . . . .
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Cytokines . . .
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T cells . . . . .
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1.3
Contents
viii
1
Introduction
1
List of Abbreviations
v
1.1.1 Epidemiology . . . . . .
1.1.2 Life cycle . . . . . . . . .
General concepts about malaria
1.1
Immunology of malaria . . . .
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1.1.3 Clinical disease . . . . .
1.2
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3
2.3
Contents
2.2.3Plasmodium berghei. . . . . . . . . . . . . .infection . . . . . . 2.2.4 Splenectomy and autotransplantation . . . . . . . . . . . . . . 2.2.5Adenovirusinfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.6 Depletion of cell types . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.7 Perfusion and lymphocyte isolation . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.8 Generation of bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) 2.2.9 Cell culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.10 Evans Blue Assay to detect BBB disruption . . . . . . . . . . . 2.2.11In vivocytotoxicity assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.12 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) . . . . . . . . Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Results 3.1 Antigen-specific immune responses during PbA induced ECM . . . . 3.1.1 Identification of H-2kb specific peptides of PbA MSP-1 . . . . 3.1.2 Antigen specific cytotoxic T cells in ECM . . . . . . . . . . . . 3.2 Immune responses againstPlasmodium bergheiare generated in the spleen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 The intact structure of the spleen is critically involved in dis-ease progression and T cell activation . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2 Autotransplantation of the spleen reverses protection . . . . 3.2.3 The splenic architecture is involved in T cell priming and dis-ease progression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Antigen-presenting cells are required for the generation ECM . . . . 3.3.1 Macrophages are involved in the generation of parasite-specific T cell responses and ECM pathogenesis . . . . . . . . 3.3.2 B cells are involved in antigen-specific effector responses and neuropathology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3 Dendritic cells are promote the generation of antigen-specific T cells and ECM development . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 Toll-like receptor 9 is involved in ECM pathogenesis and but not in effector cell generation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5Plasmodiuminduced cerebral malaria is dependent on Interleukin-12 and Interleukin-12 signalling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22 22 22 22 23 24
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28 28 28 29
32
32 33
34 35
37
39
39
41
44
ix
4
5
3.6
Contents
CD4+T cells have a vital role in generating parasite-specific responses and subsequent ECM induction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Discussion 4.1 Mouse Model of cerebral malaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 Detection of antigen-specific pathogenic T cells and the correlation with cerebral malaria pathogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3 ECM development is dependent on an intact splenic architecture and a functional interaction between APCs and effector T cells . . . . . . 4.3.1 Generation of parasite specific T cells and ECM development is macrophage dependent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2 B cells are involved in priming effector T cells andPlasmodium berghei . . . . . . . . . . . . . .induced neuropathogenesis . 4.3.3 Dendritic cells drive antigen specific T cell differentiation and induce cerebral malaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4 Toll-like-receptor-9 signalling and IL-12 promote neuropathology in Plasmodium berghei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .infection . 4.5 CD4+helper cells affect generation of parasite-specific effector re-T sponses and ECM development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . The effector phase of cerebral malaria . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.6
Conclusion
Bibliography
46
49 50
51
53
55
56
57
59
62 64
67
68
x
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