Analysis of the Chlamydophila pneumoniae and host transcriptome in the acute and iron depletion mediated persistent infection [Elektronische Ressource] / vorgelegt von André Germar Paul Mäurer

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• Publié par: julius-maximilians-universitat_wurzburg
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 20
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

Analysis of the Chlamydophila pneumoniae
and host transcriptome in the acute and
iron depletion-mediated persistent infection

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
André Germar Paul Mäurer
aus
Hürth-Hermühlheim
Würzburg 2006 Eingereicht am
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender: Prof. Dr. M. Müller
1. Gutachter: Prof. Dr. J. Hacker
2. Gutachter: Prof. Dr. T.F. Meyer
Tag des Promotionskolloquiums:
Doktorurkunde ausgehändigt am: The only constant
in the world is change.
To my parents,
and my friends.Acknowledgements
I would like to express all my gratitude to Prof. Dr. Thomas F. Meyer for giving me the
chance to do my PhD work in his lab. Also I would like to thank Dr. Hans J. Mollenkopf for
guidance and supervision in my experiments. This thesis would not be possible without their
personal and professional support.
Many thanks also to all the people in the lab, especially Marion Rother, Nicole Paland,
Dagmar Heuer, Elke Ziska, Agnes Szczepek and Adrian Mehlitz for helpful technical advice
and discussions. I will never forget the pleasant time with them during these years.
Moreover, Stefan Bentink from the MPI für Molekulare Genetik for helpful discussion about
data analysis and to Ina Wagner and Jörg Angermann for technical assistance for the array
experiments.
For carefully reading this manuscript and many ideas improving it: Dr. Michael Steinert, Dr.
Hans Mollenkopf, Nicole Paland, Marion Rother, Rajendra Kumar and Simone Hess. Selbständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur mit den
angegebenen Hilfsmitteln erstellt habe.
Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation weder in gleicher noch in anderer Form
bereits in einem Prüfungsverfahren vorgelegen hat.
Ich habe früher, außer den mit dem Zulassungsgesuch urkundlichen Graden, keine
weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben gesucht.
André Mäurer
Berlin/Würzburg, den 29.04.2006 Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das obligat intrazelluläre, gram-negative Bakterium Chlamydophila pneumoniae (Cpn) wird
mit akuten und chronischen Krankheiten in Verbindung gebracht. Besonders sein Potential
persistente Infektionen zu durchlaufen ist mit chronischen Krankheiten korreliert worden
und deshalb von besonderem Interesse. Verschiedene in vitro Zellkulturmodelle werden
verwendet um persistente Infektionen zu untersuchen, darunter IFNγ Stimulation, Antibiotika
Behandlung und Eisenmangel. Das letztere imitiert den körpereigenen Effekt, durch
Limitierung des verfügbaren Eisens Infektionen zu bekämpfen. Über die Genregulation von
Cpn als auch der Wirtzelle in der akuten und persistenten Infektion ist jedoch wenig
bekannt. Deshalb wurde in dieser Arbeit das Cpn Transkriptom als auch das von
epithelialen Wirtszellen untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Oligomikroarray, für die
Stämme CWL029, AR39 und J138, in Kooperation mit MWG AG entwickelt und validiert.
Nur ein kleiner Teil der extrahierten GesamtRNA von Cpn infizierten Zellen stammt vom
Pathogen. Ein optimierte RNA Extraktionsmethode führte zu der dreifachen Menge an
bakterieller RNA in der GesamtRNA. Dies ermöglichte es, das Cpn Transkriptom ohne
Amplifikation oder Anreicherung der Retikulärkörperchen (RK) zu untersuchen. Im Vergleich
zu Studien für C. trachomatis (Ctr) stellt diese eine erhebliche methodische Verbesserung
dar. Die Mikroarrayergebnisse wurden mittels Echtzeit-PCR (qRT-PCR) verifiziert, bei
welcher die Genexpression mit Hilfe eines Indexes verschiedener Kontrollgene normalisiert
wurde. Für die Mikroarraystudien wurde durch den Vergleich der Expressionswerte zu
einem mittleren Zeitpunkt im Entwicklungszyklus die Expressionsprofile der Gene definiert.
Mittels eines Algorithmuses für ‚selbstorganisierende Netzwerke’ (SOM) wurden signifikant
regulierte Gene aufgrund ihres Expressionsprofiles in 12 Cluster gegliedert. Während in der
Literatur der Startpunkt der Expression für die Klassifizierung der Gene verwendet wurde,
basiert dies hier auf dem Expressionsprofil der Gene. Diese 12 Cluster wurden wiederum
in die Klassen der ‘Frühen’ (engl.: ‘Early’), ‘Mittleren’ (engl.: ‘Mid’) und ‘Späten’ (engl.: ‘Late’)
Gene eingeteilt. Diese Unterteilung lehnt sich an schon beschriebenen
Genexpressionsstudien für Ctr an. Weiterhin wurde die neue Klasse der ‘Verspäteten’
(engl.: ‘Tardy’) Gene eingeführt. Diese hatten am Ende des Entwicklungszykluses ein
kontinuierlich ansteigendes Expressionsprofil. Mit publizierten Proteinen aus chlamydialen
Elementarkörperchen (EK) korrelierten vor allem Gene aus den ‘Späte’ jedoch nicht aus den
‘Verspätete’ Klassen. Gene dieser beiden Klassen müssen also eine unterschiedliche Rolle
im EK Redifferenzierungsprozess spielen. Weiterhin waren überdurchschnittlich viele mRNA
Transkripte aus der Klasse der ‘Verspäteten’ Gene in den EK vorhanden. Dies führte zu der
Annahme, daß ein Teil der initiale Proteinexpression von stabilen mRNA-Transkripten aus
der infektiösen EK Form erfolgt. Anschließend wurden, Gene, die für spezifische
Signalwege und physiologische Funktionen von Cpn kodieren, basierend auf der ‚Gene
Ontology’ während des Entwicklungszykluses untersucht. Weiterhin wurde das
Transkriptom von Cpn in der Persistenz mit dem Transkriptom der akuten Infektion Zusammenfassung
verglichen. Unter Persistenzbedingungen zeigte Cpn ein verändertes Expressionsprofil.
Hochregulierte Gene konnten akuten Clustern am Anfang des akuten Entwicklungszykluses
und herunterregulierte Gene Clustern am Ende des akuten Entwicklungszykluses
zugeordnet werden konnten. Dies legt nahe, daß es sich bei der Persistenz nicht um ein
neues Transkriptionsprofil handelt, sondern eher um eine Arretierung des Transkriptomes in
der Mitte des akuten Entwicklungszykluses. Weiterhin zeigten konvergent und divergent
orientierte Gene am Anfang des Zyklus bevorzugt ein antagonistisches Expressionsprofil,
während in Reihe angeordnete (‘tandem’) Gene ein korreliertes Expressionsprofil
aufwiesen. Bei den mit dem Cpn Stamm CWL029 durchgeführten Mikroarrayexperimenten
konnten auch Expressionswerte für einige ausschließlich für die Stämme AR39 und J138
beschriebenen Gene gemessen werden. Ein Vergleich mittels BLAST zeigte, daß diese
Gene auch im CWL029 Genom kodiert sind. Dazu gehörten mehrere Gene, welche
konvergent zu ihren Nachbargenen orientiert waren und eine Sequenzüberlappung mit
diesen aufwiesen. Darunter fielen parB, welches eine Rolle für die Trennung der DNA in der
Zellteilung spielt, und rpsD, ein alternativer Sigma-Faktor, der für die Transkription in der
späten Phase des Entwicklungszyklus verantwortlich ist. Für beide Genpaare konnte in der
frühen akuten und in der persistenten Infektion ein antagonistisches Expressionsprofil
beobachtet werden, wie es bei konvergent orientierten Genpaaren überwiegt. Mittels
quantitativer qRT-PCR wurde für rpsD gezeigt, dass vollständige mRNA-Fragmente in der
Persistenz herunterreguliert, während kurze mRNA-Fragmente hochreguliert waren. Als
Erklärung für diesen Effekt dient ein Modell, welches auf einer Kollision der RNA
Polymerasen basiert. Dieser Sigma-Faktor unabhängige Mechanismus ist in der Literatur
als ‘Transkriptionelle Interferenz’ bekannt und führt so trotz einer Promoteraktivierung zu
einer verminderten Anzahl an vollständigen mRNA Transkripten. Die Herunterregulation von
RpsD auf Proteinebene in der Cpn Persistenz ist beschrieben worden. Im letzten Teil dieser
Arbeit wurde das Wirtszelltranskriptom in der akuten und persistenten Infektion untersucht.
Infektion mit Cpn führte zu einer Hochregulation von relB, welches an alternativen NF-B
Signalwegen beteiligt ist und das anti-apoptotische Potential verstärkt. Weiterhin waren
Gene differentiell exprimiert, welche für die Zellzyklusproteine Cyclin-G2 und Cyclin-D1
sowie Inhibitoren von CDK4 kodieren. Sehr wahrscheinlich führt dies zu einem G1-S
Übergang im Zellzyklus der Wirtszelle. Interessanterweise sind viele dieser Gene im
persistenten Zustand stärker reguliert als in der akuten Infektion. Verschiedene
Metabolittransporter waren differentiell reguliert, darunter aquaporin-7, welches nur in der
Persistenz eine verminderte Expression zeigte. Die bei einer Cpn Infektion differentiell
exprimierten Wirtsgene sind damit an anti-apoptotischen Mechanismen, am Zellzyklus,
Zellproliferation und am Zellmetabolismus beteiligt. Zusammenfassen gibt diese Arbeit gibt
einen Einblick sowohl in das Transkriptom des Pathogens als auch der Wirtszelle während
der akuten und durch Eisenmangel ausgelösten persistenten Infektion als auch potentiellen
Mechanismen zu Persistenzentstehung auf der Ebene der Genregulation. Summary
Summary
The obligate intracellular gram-negative