Analysis of the functional role of synaptic adhesion molecules in mouse neurons [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Kim Nadine Pielarski
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Analysis of the functional role of synaptic adhesion molecules in mouse neurons Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf vorgelegt von Kim Nadine Pielarski aus Essen Düsseldorf, Oktober 2010 aus dem Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Referent: Prof. Dr. K. Gottmann Koreferent: Prof. Dr. C. Rose Tag der mündlichen Prüfung: Abstract Sophisticated information processing in the brain requires highly specified neuronal circuits. Besides selective synapse formation, the specific elimination of inappropriate synapses is crucial for the complex wiring of unique networks. Based on its homophilic binding properties, matching pre- and postsynaptic N-cadherin is proposed to be a key player in synaptic recognition. Accordingly, the asymmetric expression of N-cadherin might be pivotal in the selective elimination of synapses. To experimentally address this hypothesis, single ES cell-derived neurons deficient for N-cadherin (Ncad-/-) were transfected with N-cadherin, leading to its expression postsynaptically.

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Publié le 01 janvier 2011
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Analysis of the functional role of synaptic adhesion
molecules in mouse neurons









Inaugural-Dissertation



zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf


vorgelegt von

Kim Nadine Pielarski
aus Essen



Düsseldorf, Oktober 2010

aus dem Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf






















Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf



Referent: Prof. Dr. K. Gottmann
Koreferent: Prof. Dr. C. Rose

Tag der mündlichen Prüfung: Abstract

Sophisticated information processing in the brain requires highly specified neuronal circuits.
Besides selective synapse formation, the specific elimination of inappropriate synapses is
crucial for the complex wiring of unique networks. Based on its homophilic binding
properties, matching pre- and postsynaptic N-cadherin is proposed to be a key player in
synaptic recognition. Accordingly, the asymmetric expression of N-cadherin might be pivotal
in the selective elimination of synapses. To experimentally address this hypothesis, single ES
cell-derived neurons deficient for N-cadherin (Ncad-/-) were transfected with N-cadherin,
leading to its expression postsynaptically. All presynaptic neurons still lacked N-cadherin,
thus enabling the analysis of the effect of an asymmetric N-cadherin expression. Recordings
of AMPA receptor-mediated miniature postsynaptic currents (mEPSCs) 48h after transfection
revealed a significant defect in synaptic transmission, which could be demonstrated to be
caused by disturbed presynaptic vesicle release. Putative candidate molecules for heterophilic
interaction with N-cadherin are other classical cadherins. To study a cooperation with the
postsynaptically expressed N-cadherin, antagonistic peptides specifically binding to the
cadherin binding motif were applied. No effects of the peptides were observed in recordings
of AMPA receptor-mediated mEPSCs, making an involvement of classical cadherins in the
signaling pathway unlikely. In contrast, the addition of BDNF was shown to reverse
impairment of synaptic transmission. Moreover, a dependence of BDNF-induced potentiation
of synaptic activity on N-cadherin was found. However, using biochemical approaches
(coimmunoprecipitation) no direct interaction between N-cadherin and the BDNF receptors
NTRTrkB or p75 could be detected. As an impaired synaptic function may be a potential
trigger for later synapse disassembly, immunocytochemical stainings for the vesicle protein
VAMP2 were performed 8 days after transfection, revealing a reduced number of synapses. A
detailed analysis including the distinction of synapses and autapses at later maturational
stages was done by combining stainings (VAMP2) and cotransfections (PSD-GFP, N-
cadherin, DsRed2-VAMP2), confirming in fact an elimination of synapses. Moreover, this
elimination appeared to be accompanied by axon and dendrite retraction as shown by
conditional N-cadherin knockout. Additionally, a cooperation of N-cadherin and neuroligin1
in modulating synaptic function was revealed via electrophysiological recordings of AMPA-
and NMDA receptor-mediated currents.

Zusammenfassung

Für komplexe Hirnleistungen ist ein spezifisch verschaltetes neuronales Netzwerk essentiell.
Dabei ist neben der selektiven Synapsenbildung insbesondere die spezifische
Synapsenelimination unpassender synaptischer Partner ein wichtiger Faktor. Aufgrund der
starken homophilen Bindung von prä- und postsynaptischen N-Cadherin Molekülen, wird N-
Cadherin eine wichtige Rolle in der synaptischen Erkennung zugeschrieben. Folglich könnte
die asymmetrische Expression von N-Cadherin eine ebenso entscheidende Funktion in der
Elimination von Synapsen haben. Um dies zu überprüfen, wurden in der vorliegenden Arbeit
einzelne N-Cadherin defiziente Neurone mit N-Cadherin transfiziert (postsynaptische
Expression), während die präsynaptischen Zellen weiterhin kein N-Cadherin exprimierten.
Somit war es möglich, die asymmetrische Expression von N-Cadherin hinsichtlich ihrer
Auswirkung auf die Synapsenstabilität zu untersuchen. Die nach 48 Stunden gemessenen
AMPA Rezeptor-vermittelten Miniatur-EPSCs bestätigten, dass in der Tat die synaptische
Funktion beträchtlich eingeschränkt war. Als Ursache hierfür konnten Defekte in der
präsynaptischen Vesikelfreisetzung festgestellt werden. Um zu überprüfen, ob andere
klassische Cadherine als Kandidaten für eine Interaktion mit dem postsynaptischen N-
Cadherin in Frage kommen, wurden Peptide, welche spezifisch an die Cadherin-
Bindungsstelle von N-Cadherin binden, appliziert. Da diese Peptide keinen Einfluss auf die
Beeinträchtigung der synaptischen Transmission hatten, konnten klassische Cadherine als
Kooperationspartner ausgeschlossen werden. Im Gegensatz dazu bewirkte die Zugabe von
BDNF, dass sich die synaptische Aktivität normalisierte. Überdies wurde eine Abhängigkeit
der BDNF induzierten Potenzierung synaptischer Transmission von N-Cadherin festgestellt.
NTR
Eine direkte Interaktion mit den BDNF Rezeptoren TrkB oder p75 konnte allerdings
mittels biochemischer Methoden (Co-Immunopräzipitation) nicht bestätigt werden. Störungen
in der synaptischen Transmission können ein Hinwies auf bevorstehende Synapsenelimination
sein. Entsprechend zeigten Färbungen für das synaptische Vesikelprotein VAMP2 8 Tagen
nach der Transfektion eine deutliche Reduktion der Synapsen. Eine detaillierte Analyse,
welche eine Unterscheidung von Autapsen und Synapsen ermöglichte, bestätigte eine
Synapsenelimination. Darüber hinaus konnte nach konditionalem Knockout von N-cadherin
in einzelnen Neuronen eine Retraktion des Axon und der Dendriten festgestellt werden.
Zusätzlich konnte eine Kooperation von N-cadherin und Neuroligin1 in der Regulation
synaptischer Aktivität auf funktioneller Ebene durch die Analyse AMPA- und NMDA
Rezeptor-vermittelter Ströme bestätigt werden. Contents

1. Introduction 3
1.1 Organization of chemical synapses 3
1.1.1 The presynaptic terminal 4
1.1.2 Postsynaptic specializations 7
1.2 Organization of glutamatergic synapses 8
1.2.1 Ionotropic glutamate receptors 9
1.2.2 Metabotropic glutamate receptors 10
1.3 Synaptic cell adhesion molecules 11
1.3.1 Neural (N)-cadherin 11
1.3.2 Neuroligin 15
1.4 Neurotrophins 17
NTR
1.4.1 The BDNF/TrkB/p75 system 18
1.5 Selective synapse assembly and elimination 19
1.6 Aims of the study 24

2. Material and Methods 26
2.1 Solution and chemicals 26
2.1.1 Cell culture medium 26
2.1.2 Media for growing bacteria 29
2.1.3 Solutions for electrophysiological recordings 30
2.1.4 immunocytochemical stainings 31
2.1.5 Solutions for coimmunoprecipitations and Western blot 32
2.1.6 Plasmids 35
2.1.7 Peptides 36
2.1.8 Antibodies 36
2.2 Cell culture 37
2.2.1 Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem
(ES) cells 37
2.2.1.1 N-cadherin deficient mouse ES cell lines 38
2.2.1.2 Preparation and proliferation of embryonic mouse
fibroblast feeder (EF) cells 39
2.2.1.3 Culturing and in vitro differentiation of mouse ES cells 40 2.2.1.4 Dissociation of embryoid bodies 41
2.2.1.5 L1-immunoisolation of ES cell-derived neurons 41
2.2.2 The N-cadherin conditional knock-out mouse 43
2.2.3 Preparation of sterile coverslips 44
2.2.3.1 Sterilization of
2.2.3.2 Coating of sterile coverslips with Poly-L-Ornithine 45
2.2.4 Preparation and dissociation of primary cortical neurons 45
2.2.5 Setting up glial microisland cultures 46
2.2.6 Preparation of “sandwich” cultures for immunocytochemical
stainings for N-cadherin 46
2.2.7 Isolation and propagation of plasmid DNA 47
2.2.7.1 Transformation of bacteria 47
2.2.7.2 Minipreps of plasmid DNA
2.2.7.3 Maxipreps plasm
2.2.8 Transfection of ES cell-derived and neocortical neurons 48
2.2.9 Peptide experiments 48
2.3 Electrophysiological recordings
2.3.1 The “patch-clamp” technique 48
2.3.2 experimental setup 52
2.3.3. Detection of spontaneous miniature postsynaptic currents
(mPSCs) 53
2.3.4 Registration of evoked autaptic AMPA receptor-mediated
postsynaptic currents (PSCs) 54
2.3.5 Registration of evoked NMDA receptor-mediated excitatory
postsynaptic currents (EPSCs) 55
2.4 Imaging experiments

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