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Application of micropillar interfaces [Elektronische Ressource] : a study on human periodontal cells and actin biomimetic systems / vorgelegt von Simon Daniel Schulz

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Inaugural - DissertationzurErlangung der DoktorwurdederNaturwissenschaftlich - Mathematischen Gesamtfakult atderRuprecht - Karls - Universit at Heidelbergvorgelegt vonDipl.-Chem. Simon Daniel Schulzaus HeidelbergTag der mundlic hen Prufung: 31. M arz 2009Application of Micropillar Interfaces:A Study on Human Periodontal Cellsand Actin Biomimetic SystemsReferees:Prof. Dr. Joachim P. SpatzPD. Dr. Rainer DahintZusammenfassungMikrostrukturierte Ober achen wie Mikros aulen aus Polydimethyl-siloxan (PDMS)scha en einerseits einen neuartigen Ansatz zur Kultivierung von Zellen auf topo-logisch de nierten Ober achen auf denen man Kr afte messen kann. Andererseitsdienen sie auch als Gerust fur biomimetische Untersuchungen von Protein. Im er-sten Teil werden Matritzen aus PDMS-Mikros aulen, die mit Fibronektin funktionali-siert sind, als biomechanische Mikroumgebung fur immortalisierte humane Gingiva-Keratinozyten (IHGKs) und Gingiva-Fibroblasten aus dem Bindegewebe (GCTFs)verwendet. IHGKs und GCTFs adh arieren und wachsen auf den Pillark opfen. DieIHGKs ub en Kr afte von bis zu 110 nN und die GCTFs von bis zu 174 nN auf diePillark opfe aus. Eine Ver anderung der Pillarabst ande beein usst die fruhe Di eren-tiation der Keratinozyten.

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Publié le 01 janvier 2009
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Langue Deutsch
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Inaugural - Dissertation
zur
Erlangung der Doktorwurde
der
Naturwissenschaftlich - Mathematischen Gesamtfakult at
der
Ruprecht - Karls - Universit at Heidelberg
vorgelegt von
Dipl.-Chem. Simon Daniel Schulz
aus Heidelberg
Tag der mundlic hen Prufung: 31. M arz 2009Application of Micropillar Interfaces:
A Study on Human Periodontal Cells
and Actin Biomimetic Systems
Referees:
Prof. Dr. Joachim P. Spatz
PD. Dr. Rainer DahintZusammenfassung
Mikrostrukturierte Ober achen wie Mikros aulen aus Polydimethyl-siloxan (PDMS)
scha en einerseits einen neuartigen Ansatz zur Kultivierung von Zellen auf topo-
logisch de nierten Ober achen auf denen man Kr afte messen kann. Andererseits
dienen sie auch als Gerust fur biomimetische Untersuchungen von Protein. Im er-
sten Teil werden Matritzen aus PDMS-Mikros aulen, die mit Fibronektin funktionali-
siert sind, als biomechanische Mikroumgebung fur immortalisierte humane Gingiva-
Keratinozyten (IHGKs) und Gingiva-Fibroblasten aus dem Bindegewebe (GCTFs)
verwendet. IHGKs und GCTFs adh arieren und wachsen auf den Pillark opfen. Die
IHGKs ub en Kr afte von bis zu 110 nN und die GCTFs von bis zu 174 nN auf die
Pillark opfe aus. Eine Ver anderung der Pillarabst ande beein usst die fruhe Di eren-
tiation der Keratinozyten. Bei kleiner werdenden Pillarabst anden weisen die IHGKs
eine zunehmende Ausbreitung von Keratin 1 (K1) im Zytoplasma, eine zunehmende
mRNA Transkription von Keratin 1 und eine Ver anderung ihres Aussehens von einer
mehr linearen Form zu einer mehr runden Form auf. Ein neuartiges Kokultursystem
aus GCTFs und IHGKs wird entwickelt, um explizit die Rolle von GCTFs in der
Morphogenese von den so erhaltenen Epithel aquivalenten zu untersuchen. Fur Epi-
thel aquivalente, die fur 7 und 14 Tage auf Pillarfeldern kultiviert werden, auf denen
sich GCTFs be nden, wird ein Ph anotyp gefunden, der ahnlicher zu dem in vivo
Ph anotyp ist, als der, der auf GCTF-freien Kulturen gefunden wird. Diese Beobach-
tungen werden durch den mRNA Transkriptionsgrad fur Keratin 1 best atigt.
Eine neuartige, tranparente, auf PDMS-S aulen beruhende Mikro uidicplattform
wurde im zweiten Teil der Arbeit entwickelt. Diese wird hergestellt, um Modelle
des Aktinkortex zu untersuchen. Sie erlaubt die Kontrolle ub er die physikalische
und chemische Umgebung und erm oglicht Beobachtungen mittels hoch au osenderii
Fluoreszenzmikroskopie. Es wird die Bildung von mit Filamin, Myosin II,-Aktinin
und Magnesiumionen vernetzten Netzwerken beobachtet. Abh angig von der geo-
metrischen Anordnung der auf den Pillark opfen verankerten Aktin lamenten asstl
sich eine rei verschlussartige Vernetzungen beobachen. Die Vernetzungsgeschwindig-
keit dieses so genannten Rei verschlusses wird sowohl durch die Flussgeschwindig-
keit als auch durch die Anzahl und Anordnung der in diesem Prozess involvierten
Filamente beein usst. Hierbei zeigt sich eine Geschwindigkeit zwischen 2-15 m/s.
Um den Vernetzungsprozess weiter zu quanti zieren, wird die Flusszelle mit einer
optischen Pinzette kombiniert. Die Entnetzungskr afte werden fur die Vernetzungs-
mediatoren -Aktinin und Magnesiumionen gemessen. Fur Magnesiumionen wird
eine Kraft von 17-20 pN and fur -Aktinin von 30-45 pN erhalten.Abstract
Microstructured interfaces such as micropillars made of polydimethyl - siloxane
(PDMS) provide a novel approach both as topologically de ned, force sensing sub-
strates in cell culture as well as sca olds for biomimetic protein assays.
This work is divided into two parts.
In the rst part, PDMS micropillar arrays functionalized with bronectin, are ap-
plied as a biomechanical microenvironment for immortalized human gingival ker-
atinocytes (IHGKs) and gingival connective-tissue broblasts (GCTFs). IHGKs and
GCTFs show successful adhesion and growth on the pillar heads and exert forces up
to about 110 nN in the case of IHGKs and about 174 nN for GCTFs. Varying the
interpillar distances a ects the early keratinocyte di erentiation and morphology.
At decreasing inter-pillar distances the IHGKs show an increased keratin 1 (K1)
extension in the cytoplasm, increased mRNA transcription of keratin 1 and a shape
change from a more linear to a more round form. A novel GCTF-IHGK co-culture
system is developed as a model of the epithelial tissue, to study explicitly the role of
the GCTFs in the morphogenesis of the derived epithelial equivalents. The epithelial
equivalents, cultured for 7 and 14 days on GCTF-populated pillar arrays, are found
more similar to the in vivo phenotype than the GCTF-free cultures. These ndings
are con rmed by following the mRNA transcription levels for keratin 1.
A novel, transparent micro uidic platform, based on PDMS pillars is developed
in the second part of this work. It is designed to investigate actin cortex models
and to provide control over the physicochemical environment, allowing simultaneous
high resolution uorescence microscopy. The formation of crosslinking networks is
observed using various crosslinkers, such as lamin, myosin II, -actinin and magne-
sium ions. Dependent of the geometric con guration of the actin laments anchorediv
to the pillar tops, so-called zipping crosslinks are observed. The zipping velocity is
both in uenced by the ow speed, as well as the number and the con guration of
the laments involved in the process. It is found to range between 2 - 15 m/s. To
further quantify the crosslinking process, the ow-cell is combined with an optical
tweezers system. The unzipping forces are measured for the crosslinkers -actinin
and magnesium ions. Forces of about 17 - 20 pN are derived for magnesium ions
and about 30 - 45 pN for -actinin.Contents
Zusammenfassung i
Abstract iii
1 General Introduction and Motivation 1
I Periodontal Cells on Microstructured Surfaces 3
2 Introduction 5
2.1 Intermediate Filaments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3 Materials and Methods 15
3.1 Fabrication of Micropillar Arrays for Cell Adhesion . . . . . . . . . . 15
3.1.1 Micropillar Fabrication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Fabrication of the Chromium Photomask . . . . . . . . . . . . 16
F of the SU-8 Master . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
PDMS-casting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.1.2 Pillar Functionalization with Fibronectin . . . . . . . . . . . . 19
3.1.3 Force Measurements on Micropillar . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2 Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3 Generation of Co-Cultures (CCs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.4 Indirect Immuno ourescence (IIF) of IHGKs on Micropillars . . . . . 26
3.4.1 IHGKs on Micropillars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.4.2 GCTFs on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27vi Contents
3.4.3 IHGK Co-Cultures on Micropillars . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.5 RNA Extraction and Quantitative Real-time PCR Analysis . . . . . . 28
3.5.1 IHGKs on Micropillars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.5.2 GCTFs and Epithelial Equivalents . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.6 Scanning Electron Microscopy (SEM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4 Early Keratinocyte Di erentiation on Micropillar Interfaces 31
4.1 Creation of an in vitro Model Surface for IHGKs . . . . . . . . . . . 32
4.1.1 Traction Forces exerted by Keratinocytes on Micropillar Fields. 35
4.2 Keratinocyte Morphology and Expression of K1 and K10 on Mi-
crostructured Surfaces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.1 Morphology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2.2 Expression of K1/10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5 GCTFs and Epithelial Equivalents on Micropillars 47
5.1 GCTFs on Micropillars . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.2 Co-Cultures of GCTFs and IHGKs on Micropillars . . . . . . . . . . 52
6 Conclusion and Outlook 57
II Biomimetic Actin Networks 61
7 Introduction 63
7.1 Protein laments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.1.1 Microtubules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.1.2 Intermediate Filaments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.1.3 Actin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.2 Actin Binding Proteins (ABPs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
7.2.1 Filamin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
7.2.2 -Actinin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
7.2.3 Myosin II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.3 Optical Tweezers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
8 Materials and Methods 77
8.1 Micro uidic Devices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77