Associations antimétabolites fluoropyrimidiques-thérapies ciblées : étude des déterminants moléculaires de réponse et non-réponse, Targeted therapy-fluoropyrimides combination : study of molecular determinants

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Sous la direction de Joseph Ciccolini, Gérard Milano
Thèse soutenue le 13 juillet 2010: Aix Marseille 2
Associer les thérapies ciblées et la chimiothérapie cytotoxique constitue un axe thérapeutique extrêmement prometteur en oncologie clinique. La combinaison des fluoropyridines orales de dernière génération (capécitabine) aux inhibiteurs de tyrosine kinase (erlotinib, lapatinib)a ainsi été proposée dans divers contextes cliniques, avec une efficacité variable, allant de l'échec (pancréas) à la réponse thérapeutique (sein). L'objectif de ce travail de recherche est de dégager, sur des modèles expérimentaux non-cliniques, un rationnel pharmacologique d'utilisation de la capécitabine avec divers TKI. Ce travail se focalise notamment sur l'étude de la modulation des déterminants de réponse aux drogues dans les modèles pancréatiques(association capecitabine + erlotinib) et mammaires (capecitabine + lapatinib). Nous avons ainsi pu montrer les effets délétères de l'association erlotinib-capecitabine dans les modèles pancréatiques chimio-résistants, liés d'une part à un effet represseur de l'expression du récepteur à l'EGF par la capécitabine, combiné à une sécrétion exocrine de VEGF en réponse aux diverses séquences d'association testées. Ces effets se sont soldés par l'obtention de réponses antagonistes aux drogues combinées, comparativement aux monothérapies respectives. Nos données suggèrent que quelle que soit la séquence d'utilisation envisagée,capecitabine et erlotinib ne devraient jamais faire l'objet d'association. A contrario, l'étude de l'association lapatinib-capecitabine sur diverses lignées mammaires a permis de mettre en évidence un effet positif allant de la supra-additivité à la synergie. Nos données suggèrent que c'est d'une part par une dérégulation de la thymidylate syntahse par le lapatinib qu'une plus grande efficacité anti-proliférative est obtenue. Par ailleurs, une meilleure inhibition de la voie p-AKT après exposition à la capécitabine des cellules traitées par le lapatinib pourraitde surcroît expliquer la synergie observée. Nos données suggèrent qu'une utilisation concomitante de ces deux molécules devrait garantir un gain d'efficacité optimal. La synergie de l'association a été conservée sur un modèle de souris porteuses de tumeurs mammaires ectotopiques et traitées de façon concomitante, avec un net ralentissement de la croissance tumorale comparativement aux animaux traités par monothérapie, sans augmentation de la toxicité médicamenteuse.En conclusion, nos données illustrent le fait que les associations thérapiesciblées/antimétabolites doivent faire l'objet systématiquement d'un travail préalable de recherche des déterminants oncopharmacologiques d'efficacité afin d'anticiper le gain d'efficacité qu'on est en droit d'en tirer, et d'identifier au mieux les modalités d'association de ces drogues.
-Capecitabine
-Thérapie ciblée
-Oncologie
-Egfr
-Oncopharmacologie
-Xénogreffe
Optimizing cancer treatments remains an on going task. The rise over the last decade of a new class of anticancer agents (the so-called “targeted therapies”) has fuelled agreat hope in the search for achieving better response with lower toxicities. To date,the actual efficacy of targeted therapies used alone looks in some respect below the initial expectations, and associating them with classic cytotoxic drugs represents therefore a new promising combinational strategy in clinical oncology. However, littleis known on the pharmacologic rationale for combing these drugs, and identifying molecular determinants could help to rationalize the way the drugs should beassociated. Anti-EGFR erlotinib (Tarceva®) has been approved for the treatment of patients with metastatic pancreatic cancer, in combination with a standard chemotherapy, gemcitabine, both in the USA and in Europe. Its combination with capecitabine has recently been tested in patients with gemcitabine-refractorypancreatic tumours, with limited success. Lapatinib (Tykerb®) is an innovative small molecule with unique dual-TK inhibitory action against both HER1 and HER2.Lapatinib showed clinical efficacy in various models and has heightened the expectation for new breast cancer therapies. Associating lapatinib with capecitabine(Xeloda®) has been recently approved for the treatment of patients with HER2+metastatic breast cancer, after failure of trastuzumab treatment, both in the USA andin Europe as well. The aim of our work was to study, either in vitro or in tumor bearing animals, the effects of these drugs used either alone or in combination. In this preclinical study, we studied the molecular determinants of this new targeted therapies + antimetabolite association on various, representative human pancreatic and breast cancer cell lines. Efficacy and apoptosis experiments were performed after concomitant and various sequential combinations, along with study ofresponse/resistance determinants such as dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD),thymidylate synthase (TS), thymidine phosphorylase (TP), Bax, Bcl-2, P21 andHER1/2 signaling pathway. Determination of Chou & Talalay combination indices (CI)allowed us to determine whether the tested associations led to synergism, additivity or antagonism. The best sequences found were transposed to tumor-bearing animal model for in vivo confirmation of the efficacy observed in vitro. Lapatinib andcapecitabine showed additive to moderate synergistic effects in our breast cancer celllines. Further experiments were performed to identify the mechanisms underlyingthis efficacy. We first found that lapatinib down-regulates thymidylate synthase (-30%) but did not have any effect on dihydropyrimidine dehydrogenase levels, thussuggesting theoretically a better cytotoxic effect of capecitabine within tumor cellspreliminary exposed to Lapatinib. Besides, capecitabine, when added to lapatinib,strongly down-regulates P-AKT and p-P42/44, thus allowing a deeper inhibition of the downstream signaling pathway after inhibition of HER1 and HER2. Muchinterestingly, we showed as well an increase of the Bax/Bcl2 ratio in cells exposed toboth drugs, leading to the enhancement of apoptosis induction and cell death. Thisfinding is fully consistent with the fact that the association of lapatinib andcapecitabine led to an increase of the P21 protein expression and consequently tothe arrest of cell cycle indeed. Besides, in pancreatic cancer cell lines, wedemonstrated that erlotinib up-regulated thymidine phosphorylase (+50%) anddown-regulated dihydropyrimidine dehydrogenase (-55%), thus suggestingtheoretically a better activation of capecitabine within tumor cells preliminaryexposed to erlotinib. We checked as well that Bax, P27, p-AKT were fully functionalin our models. Nevertheless, when not antagonist, only moderate additive effectswere achieved. To understand these rather surprising results, further experimentswere performed to identify the putative causes of this lack of efficacy. We first foundthat capecitabine down-regulates EGFR (-35%) in capan-1 cells with no effect on itsdownstream signalisation pathway nor antiproliferative related effects, thussuggesting a possible loss of efficacy when cells were subsequently treated witherlotinib due to the diminution of its target. Much interestingly, we showed as well adramatic overexpression of both cytosolic (+100 up to +1900%) and extra-cellular(+100 up to 3500%) VEGF secretion in response to our treatments, leading possibly to a boost in cell proliferation. Taken together, this in vitro study suggests that themore-than-additive efficacy observed when associating lapatinib and capecitabine inbreast cancer is based upon TS modulation and down-regulation of HER1/2 signalingpathways, resulting in apoptosis and cell death eventually. In vivo experiments are ongoing to fully confirm these data. Concerning the erlotinib/capecitabineassociation in pancreatic cancers, we suggest that VEGF secretion could be a new,major mechanism of resistance to the erlotinib + capecitabine association inpancreatic cancers, and, possibly, to other targeted therapy + antimetabolitescombinations. To test this hypothesis, further experiments including the use of anti-VEGF bevacizumab will be undertaken.
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22955/document

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Université de la Méditerrané
Aix-Marseille II Aix-Marseille II
Ecole doctorale : Environnement et Santé. Ecole doctorale : Environnement et Santé.

THESE
Présentée pour obtenir le titre de Docteur ès Sciences de l’Université de la Méditerranée.
Aix-Marseille II.
Spécialité : Oncologie : Pharmacologie et Thérapeutique.
(arrêtés ministériels du 5 juillet 1984 et du 30 mars 1992)
par :

Mohamed CHEFROUR

Associations Antimétabolites fluoropyrimidiques/Thérapies ciblées:
Etude des Déterminants Moléculaires de réponse et de non-réponse.

Soutenue publiquement à Marseille le 13 Juillet 2010
Pr. Athanassios ILIADIS, Université de la Méditerranée, Président.
Dr. Joseph CICCOLINI, Université de la Méditerranée, Directeur.
Dr Gérard MILANO, Centre Antoine Lacassagne, Nice, Directeur.
Dr Amélie LANSIAUX, Université de Lille, Rapporteur.

Pr. Pierre CUQ, Université de Montpellier. Rapporteur.
Dr Cédric MERCIER, AP-HM, Marseille. Examinateur.

Dr Jean-Louis FISCHEL, Centre Antoine Lacassagne, Nice. Examinateur.

Remerciements :
Je tiens tout d'abord à remercier Mr le Professeur Athanassios ILIADIS, pour m'avoir
accueilli au sein de son laboratoire de toxicocinétique et pharmacocinétique de Marseille, et
pour les conseils stimulants qu’il m’a fait l’honneur de me prodiguer.
Je tiens à exprimer ma gratitude et ma reconnaissance envers Mme le Dr Amélie LANSIAUX
et Mr le Pr Pierre CUQ, rapporteurs, qui m’ont fait l’honneur de consulter et corriger ce
travail malgré leurs charges académiques et hospitalières.
Au Dr Cédric MERCIER, toute ma reconnaissance et mon profond respect pour tes conseils
et ton aide précieuse durant ces années de recherche. Merci d’avoir accepter d’examiner ce
travail.
Mes remerciements vont également à Mr le Dr Gérard MILANO, Co-directeur de Thèse,
Responsable du Laboratoire d’Oncopharmacologie, Directeur de la Recherche du Centre
Antoine Lacassagne, pour son soutien financier et moral et pour la gentillesse et la patience
qu'il a manifestées à mon égard durant mon séjour. Je te serai toujours reconnaissant
Gérard !!!
Je remercie Mr le Dr Joseph CICCOLINI qui, en tant que Co-directeur de Thèse, s'est
toujours montré à l'écoute et très disponible tout au long de la réalisation de ce travail de
recherche. Merci pour m’avoir guidé, encouragé et pour la liberté d’action et d’autonomie
que tu m’as accordé.
Au Dr Jean-Louis FISCHEL, toute ma gratitude pour m'avoir suivi, aidé et fait preuve d'une
disponibilité totale à mon égard. Votre œil critique m'a été très précieux pour structurer mon
travail et pour améliorer la qualité des différentes manipulations et présentations. Je
n’oublierai jamais le goût de vos bonbons à l’anis (Flavigny).

Mes plus chaleureux remerciements s’adressent tout particulièrement à Mme Patricia
FORMENTO qui a participé plus qu’activement à tous les aspects techniques de ce travail. Elle m’a permis de découvrir et d’approfondir un grand nombre de technique du laboratoire
qui fait mon bagage. Ce travail lui doit beaucoup !!!
Je remercie aussi Melle Sarah GIACOMETTI technicienne du laboratoire de
Pharmacocinétique et de Toxicocinétique, pour sa gentillesse, sa sympathie et son aide
précieuse. Merci beaucoup Samour !!!
J’en aurai garde d’oublier de remercier les autres membres des deux laboratoires : Loulou,
Mimi, Nini, Claude, Muriel, Nicolas, Hafedh, Christian, Federico,,, qui m’ont toujours aidé
dans mes démarches et mes expériences et …avec le sourire !!!
Mes remerciements et ma reconnaissance vont particulièrement à mes parents qui m’ont
offert l’opportunité de faire ces études et qui ont contribué plus qu’activement à ma réussite.
Merci pour votre soutien et votre patience. J’espère être à la hauteur de vos espérances !!
A mes frères Imed-Eddine et Brahim, à mes sœurs Rim & Zahra, pour leur soutien et leur
amour, un Grand Merci.
Enfin, à toi Safia, Merci de m’avoir soutenu ou plutôt supporté pendant les moments difficiles
…avec le sourire. Merci d’être ma Femme.






J’aurais grâce à vous tous compris que le travail du chercheur demeure avant tout le travail
d’un groupe de chercheurs.


SOMMAIRE:
SUMMARY....................................................................................................................P3
A) Introduction:……………………………………………………………………...p6
I) Généralités sur le cancer :
1. Le Cancer du Pancréas: Le plus mortel des cancers !! ……………………………...p11
1.1 Etat des lieux ……………………………………………………………….…….………...p11
1.2 Prise en charge et traitement : ………………………………………………….………..p12
1.2.1 Traitement chirurgical…………………………………………………………p12
1.2.2 Traitement radiothérapeutique ………………………………………………..p12
1.2.3Traitement médicamenteux :
a) La Gemcitabine: …………………………………….…p12
b) Les Combinaisons Cytotoxiques ……………………...p13
c) Les Thérapies Biologiques Ciblées.…...p14
1.3 Directions Futures…………………………………………………………………………..p15

2. Le Cancer du Sein: Le Cancer le plus fréquent chez les femmes
2.1 Etat des lieux : …………………………………………………………………..……….p16
2.2 Prise en charge et traitement:……………………………………………………..…...p16
2.2.1 Prise en charge chirurgicale……………………………………………..…...p17
2.2.2 Prise en charge radiothérapeutique………………………………………....p17
2.2.3 Prise en charge médicale :…………………………………………………….p18
a) L'hormonothérapie……………………………………………...p18
b) La chimiothérapie ……………………………………………...p19
c) Les agents biologiques………………...……………….…...…..p20
d) Les thérapies systémiques de support……………………..........p22
2.3. Conclusions………………………………………………………………….…...p23
II. Chimiothérapie Cytotoxique: « Focus sur le 5-Fluorouracil oral».

1. Le 5-Fluorouracile (5-FU) oral: ancêtre des thérapies ciblées ?.................................p24
2. Voies Métaboliques de la Capecitabine
2.1 Métabolisme hépatique :………………………………………………….….p26
2.2 Activation intratumorale de la capecitabine ………………….………….…..p27
3. Mécanismes d’actions de la capecitabine
3.1. Inhibition de la Thymidilate Synthase:……………………………………....…..p29 3.2. Action Sur l’ADN :…………………………………………………………..…..p30
3.3 Action Sur l’ARN :…………………………………………………………...…..p30
3.4 Autres Mécanismes………………………………………………………..……..p31
III. Les Thérapeutiques Moléculaires Ciblées
1. Généralités …………………………………………………………………….…....p32
2. Ciblage du récepteur HER-1…………………………………………………………p35
3. Ciblage du récepteur HER2 ……………………………………………………...….p38
4. Individualisation des traitements systémiques ……………………………….……..p41
VI. Les associations Thérapies ciblées/ antimétabolites: 5-FU et thérapies ciblées …...p42

B) Travaux personnels:
1. Etude Préclinique de La combinaison Tarceva®/Xeloda® dans le Cancer du Pancréas.
1.1. Introduction ……………………………………………………………….……….p47
1.2. Objectifs ………………………………………………………………..………….p49
1.3. Matériels & Méthodes …………………………………………………...……….p50
1.4. Résultats, Discussion et Conclusion …………………………………………...…..p59
1.5 Article 1……………………………………………………………………………..p64
® ®
2. Etude Expérimentale de l’Association Tyverb /Xeloda dans le Cancer du Sein:
Recherche de Déterminants de la Réponse
2.1. Introduction …………………………………………………………………….…..p65
2.2. Objectifs ……………………………………………………………………………p66
2.3. Matériels & Méthodes ……………………………………………………………..p66
2. 4. Résultats, Discussion et Conclusion…………………………………………….….p70
2.5 Article 2. ……………………………………………………………………………p81
C) Discussion Générale et Perspectives……………………………………………….p82
D) Bibliographie………………………………………………………………..….….…p86
E) Annexe : Protocoles Opératoires………………………………………………..…..p97
SUMMARY:
Optimizing cancer treatments remains an ongoing task. The rise over the last decade
of a new class of anticancer agents (the so-called “targeted therapies”) has fuelled a
great hope in the search for achieving better response with lower toxicities. To date,
the actual efficacy of targeted therapies used alone looks in some respect below the
initial expectations, and associating them with classic cytotoxic drugs represents
therefore a new promising combinational strategy in clinical oncology. However, little
is known on the pharmacologic rationale for combing these drugs, and identifying
molecular determinants could help to rationalize the way the drugs should be
®associated. Anti-EGFR erlotinib (Tarceva ) has been approved for the treatment of
patients with metastatic pancreatic cancer, in combination with a standard
chemotherapy, gemcitabine, both in the USA and in Europe. Its combination with
capecitabine has recently been tested in patients with gemcitabine-refractory
®pancreatic tumours, with limited success. Lapatinib (Tykerb ) is an innovative small
molecule with unique dual-TK inhibitory action against both HER1 and HER2.
Lapatinib showed clinical efficacy in various models and has heightened the
expectation for new breast cancer therapies. Associating lapatinib with capecitabine
®(Xeloda ) has been recently approved for the treatment of patients with HER2+
metastatic breast cancer, after failure of trastuzumab treatment, both in the USA and
in Europe as well. The aim of our work was to study, either in vitro or in tumor-
bearing animals, the effects of these drugs used either alone or in combination. In
this preclinical study, we studied the molecular determinants of this new targeted
therapies + antimetabolite association on various, representative human pancreatic
and breast cancer cell lines. Efficacy and apoptosis experiments were performed
after concomitant and various sequential combinations, along with study of
response/resistance determinants such as dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD),
thymidylate synthase (TS), thymidine phosphorylase (TP), Bax, Bcl-2, P21 and
HER1/2 signaling pathway. Determination of Chou & Talalay combination indices (CI)
allowed us to determine whether the tested associations led to synergism, additivity
or antagonism. The best sequences found were transposed to tumor-bearing animal
model for in vivo confirmation of the efficacy observed in vitro. Lapatinib and
capecitabine showed additive to moderate synergistic effects in our breast cancer cell lines. Further experiments were performed to identify the mechanisms underlying
this efficacy. We first found that lapatinib down-regulates thymidylate synthase (-
30%) but did not have any effect on dihydropyrimidine dehydrogenase levels, thus
suggesting theoretically a better cytotoxic effect of capecitabine within tumor cells
preliminary exposed to Lapatinib. Besides, capecitabine, when added to lapatinib,
strongly down-regulates P-AKT and p-P42/44, thus allowing a deeper inhibition of
the downstream signaling pathway after inhibition of HER1 and HER2. Much
interestingly, we showed as well an increase of the Bax/Bcl2 ratio in cells exposed to
both drugs, leading to the enhancement of apoptosis induction and cell death. This
finding is fully consistent with the fact that the association of lapatinib and
capecitabine led to an increase of the P21 protein expression and consequently to
the arrest of cell cycle indeed. Besides, in pancreatic cancer cell lines, we
demonstrated that erlotinib up-regulated thymidine phosphorylase (+50%) and
down-regulated dihydropyrimidine dehydrogenase (-55%), thus suggesting
theoretically a better activation of capecitabine within tumor cells preliminary
exposed to erlotinib. We checked as well that Bax, P27, p-AKT were fully functional
in our models. Nevertheless, when not antagonist, only moderate additive effects
were achieved. To understand these rather surprising results, further experiments
were performed to identify the putative causes of this lack of efficacy. We first found
that capecitabine down-regulates EGFR (-35%) in capan-1 cells with no effect on its
downstream signalisation pathway nor antiproliferative related effects, thus
suggesting a possible loss of efficacy when cells were subsequently treated with
erlotinib due to the diminution of its target. Much interestingly, we showed as well a
dramatic overexpression of both cytosolic (+100 up to +1900%) and extra-cellular
(+100 up to 3500%) VEGF secretion in response to our treatments, leading possibly
to a boost in cell proliferation. Taken together, this in vitro study suggests that the
more-than-additive efficacy observed when associating lapatinib and capecitabine in
breast cancer is based upon TS modulation and down-regulation of HER1/2 signaling
pathways, resulting in apoptosis and cell death eventually. In vivo experiments are
ongoing to fully confirm these data. Concerning the erlotinib/capecitabine
association in pancreatic cancers, we suggest that VEGF secretion could be a new,
major mechanism of resistance to the erlotinib + capecitabine association in pancreatic cancers, and, possibly, to other targeted therapy + antimetabolites
combinations. To test this hypothesis, further experiments including the use of anti-
VEGF bevacizumab will be undertaken.












A- Introduction
I) Les cancers solides chez l’adulte, un problème de santé publique :

En 2006, un total de 149000 décès par cancer a été enregistré en France, 88500
chez l’homme et 60500 chez la femme. En 2005, on estime que 319 000 nouveaux
cas de cancers ont été diagnostiqués, 183000 chez les hommes et 136000 chez les
femmes. Dans l’ensemble, la mortalité diminue pour toutes les localisations
fréquentes dans les années récentes, sauf pour le poumon chez la femme et le
pancréas pour les deux sexes. Le taux d’incidence a augmenté de 38 % entre 1980
et 2005, hors évolution démographique. Cette évolution résulte, chez l’homme,
essentiellement de l’augmentation de l’incidence du cancer de la prostate et, chez la
femme, principalement des augmentations des cancers du sein et du poumon [1].









Fig1 : Incidence des différents cancers solides chez l’homme et la femme depuis 1950.
Source : www.oncoprof.net

Bien que l’étiologie des pathologies cancéreuses demeure en grande partie inconnue,
on estime que des altérations génétiques sont à l’origine de la plupart des
phénomènes de carcinogénèse. Ainsi dans les tumeurs digestives, la combinaison de
l’inactivation du gène suppresseur de tumeur APC, de la mutation de l’oncogène Ha-
ras suivi de l’inactivation du gène suppresseur de tumeur p53 sont fréquemment
évoqués. De façon notable, le type d’altérations génétiques et la chronologie de
l’apparition de celle-ci sont variables d’un cancer à l’autre. Ainsi, APC n’est altéré que
dans les cancers du côlon mais jamais dans les cancers de la peau. D’autres
mutations en revanche se retrouvent, de façon commune, dans un grand nombre de
manifestations cancéreuses, telle la mutation touchant la protéine P53, le « gate-
keeper gene » dont la dérégulation aura pour conséquence une perte de mort
cellulaire programmée ou apoptose. Cette très grande diversité génétique explique
l’hétérogénéité de la pathologie cancéreuse, y compris au sein d’une même
localisation. Les sous-types histologiques (cancer bronchiques à petite cellule ou non-
à petites cellules, par exemple) trouvent leur origine en partie dans le type de
mutations génétiques sous-jacentes.
Cette hétérogénéité est capitale en cela qu’elle va impacter sur la stratégie
thérapeutique. De nouvelles disciplines telle l’oncogénétique vise, en cartographiant
génétiquement un cancer, à en dessiner le contour biologique afin de proposer une
prise en charge thérapeutique adaptée. Au type histologique, défini historiquement
par un examen anatonopathologique, s’additionne désormais une signature
génétique renseignant sur le caractère plus ou moins spontanément invasif d’un
cancer, voire sur sa capacité angiogénique. La connaissance précoce de ces
informations, encore une fois, permet de décider au plus tôt une stratégie
thérapeutique adaptée.