Autoantikūniai ant šunų eritrocitų ir trombocitų: nustatymas ir funkcinė svarba ; Auto-antibodies on canine erythrocytes and platelets: detection and functional significance

Aldona

Description

Doctoral dissertation was done in Lithuanian veterinary academy (LVA) and the Immunology Unit, School of Veterinary Medicine, Hannover (Germany) in LITHUANIAN VETERINARY ACADEMY 2000-2004. The right to confer doctoral degree was given to LVA together with Lithuanian Veterinary Institute by decision of Government of the Republic of Lithuania No. th 926, on 15 of July 2003. Dissertation is written in English. The research supervisor: Prof. habil. dr. Juozas Pieškus (LVA, biomedical science, veterinary medicine, 12B). Chairman of the defence council: Prof. habil. dr. Henrikas Žilinskas (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B). Gintar ė Ku činskien ė Members: Prof. at Incumbent, dr. Antanas Sederevi čius (LVA, biomedical sciences, AUTO-ANTIBODIES ON CANINE ERYTHROCYTES AND veterinary medicine, 12B); PLATELETS: DETECTION AND FUNCTIONAL Prof. at Incumbent, dr. J ūrat ė Šiugždait ė (LVA, biomedical sciences, veterinary SIGNIFICANCE medicine, 12B); Dr. Ar ūnas Stankevi čius (LVA Veterinary Institute, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Dr. Algirdas Šalomskas (LVA Veterinary Institute, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B). Opponents: Prof. at Incumbent, habil. dr.Saulius Petkevi čius (LVA, biomedical sciences, Summary of doctoral dissertation veterinary medicine, 12B); Prof. habil. dr.

Sujets

• Autoimmune hemolytic anemia
• Idiopathic thrombocytopenic purpura
• Immune complex
• Cluster of differentiation
• Monoclonal antibodies
• Red blood cell
• Veterinary medicine

Informations

• Publié par: lithuanian_veterinary_academy
• Publié le: 01 janvier 2005
• Nombre de lectures: 59

Extrait

  LITHUANIAN VETERINARY ACADEMY  

        Gintar  Ku č inskien      AUTO-ANTIBODIES ON CANINE ERYTHROCYTES AND PLATELETS: DETECTION AND FUNCTIONAL SIGNIFICANCE             Summary of doctoral dissertation Biomedical sciences, veterinary medicine (12B)                

Kaunas, 2004

Doctoral dissertation was done in Lithuanian veterinary academy (LVA) and the Immunology Unit, School of Veterinary Medicine, Hannover (Germany) in 2000-2004.   The right to confer doctoral degree was given to LVA together with Lithuanian Veterinary Institute by decision of Government of the Republic of Lithuania No. 926, on 15 th of July 2003.   Dissertation is written in English.   The research supervisor: Prof. habil. dr. Juozas Piekus (LVA, biomedical science, veterinary medicine, 12B).   Chairman of the defence council: Prof. habil. dr. Henrikas ilinskas (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B).   Members: Prof. at Incumbent, dr. Antanas Sederevi č ius (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Prof. at Incumbent, dr. J  rat  iugdait  (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Dr. Ar  nas Stankevi č ius (LVA Veterinary Institute, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Dr. Algirdas alomskas (LVA Veterinary Institute, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B). Opponents: Prof. at Incumbent, habil. dr.Saulius Petkevi č ius (LVA, biomedical sciences, veterinary medicine, 12B); Prof. habil. dr. Vytas Antanas Tamoi  nas (Institute of Immunology of Vilnius University, biomedical sciences, biology, 01B).   Doctoral dissertation defence will take place on 5 th November   of 2004 at the Lithuanian Veterinary Academy I a. 10 am LT. Address: Til  s 18, LT-47181, Kaunas, Lithuania.   The abstract of doctoral dissertation has been sent on 5 th   of October 2004 according sealed listing.   Doctoral dissertation is available in the libraries of Lithuanian veterinary Academy and LVA Veterinary Institute.  2

    LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA                       Gintar  Ku č inskien        AUTOANTIK  NAI ANT UN  ERITROCIT  IR TROMBOCIT  : NUSTATYMAS IR FUNKCIN  SVARBA         Daktaro disertacijos santrauka Biomedicinos mokslai, veterinarin  medicina (12B)        

           

Kaunas, 2004   3

Darbas atliktas Lietuvos veterinarijos akademijoje (LVA) ir Hanoverio veterinarin  s medicinos mokyklos Imunologijos laboratorijoje 2000-2004 m.     Doktorant  ros teis  LVA kartu su Lietuvos veterinarijos institutu suteikta 2003 m. liepos m  n. 15 d. LR Vyriausyb  s nutarimu Nr. 926.   Disertacija parayta angl  kalba.   Mokslinis vadovas: prof. habil. dr. Juozas Piekus (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin  medicina, 12B).   Disertacija ginama LVA veterinarijos medicinos mokslo krypties taryboje. Pirmininkas: prof. habil. dr. Henrikas ilinskas (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin  medicina, 12B).     Nariai: e. prof. p. dr. Antanas Sederevi č ius (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin  medicina, 12B); e. prof. p. dr. J  rat  iugdait  (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin  medicina, 12B); dr. Ar  nas Stankevi č ius (LVA Veterinarijos Institutas, biomedicinos mokslai, veterinarin  medicina, 12B); dr. Algirdas alomskas (LVA Veterinarijos Institutas, biomedicinos mokslai, veterinarin  medicina, 12B).   Oponentai: e. prof. p. habil. dr. Saulius Petkevi č ius (Lietuvos veterinarijos akademija, biomedicinos mokslai, veterinarin  medicina, 12B); prof. habil dr. Vytas Antanas Tamoi  nas (VU Imunologijos institutas, biomedicinos mokslai, biologija, 01B).   Disertacija bus ginama vieame Veterinarin  s medicinos mokslo krypties tarybos pos  dyje 2004 m. lapkri č io 5 d. 10 val. Lietuvos veterinarijos akademijos I auditorijoje. Adresas: Til  s 18, LT-47181 Kaunas, Lietuva.   Disertacijos santrauka isiuntin  ta 2004 m. spalio 5 d. pagal patvirtint ą  adres    s ą ra ą . Disertacij ą  galima peri  r  ti Lietuvos veterinarijos akademijos ir LVA Veterinarijos instituto bibliotekose.

 4

   VADAS    Statistikos duomenimis, po irdies ir kraujagysli   bei v  ini    susirgim   autoimunin  s ligos uima tre č i ą j ą  viet ą  pagal sergamum ą   (Slauson and Cooper, 2002). un   autoimunin   hemolitin   anemija (AIHA) bei trombocitopenija (AITP arba IMTP) yra taip pat vienos daniausi   autoimunini   un   lig   (Day, 1999a,c; Pedersen, 1999). Literat  ros duomenimis, mirios citopenijos (eritropenija ir trombocitopenija), dar inomos Evans sindromo pavadinimu, aptinkamos 12-18 proc. pacient  (Jackson and Kruth, 1985; Klag et al., 1993). AIHA/AITP apib  dinamos eritrocit   ar trombocit   alinimu i organizmo d  l ant j   paviriaus prisijungusi   autoantik  n  . Ta č iau i esm  s autoantik  nai negali b  ti traktuojami tik neigiamai  esant  prastai fiziologinei organizmo b  senai, jie b  tini i organizmo senstan č ioms l ą stel  ms alinti. Nedaug fiziologini  autoantik  n  organizme aptinkami ir ant sveik  eritrocit  bei trombocit  . Iki iol n  ra nustatyta koreliacijos tarp prie l ą steli   prisijungusi    patologini   autoantik  n   kiekio bei eritrocit   ar trombocit   alinimo in vivo . Yra duomen  , kad net nedaug prie min  t   l ą steli   prisijungusi    autoantik  n   gali sukelti autoimunines citopenijas (Garratty, 1991). Tod  l AIHA ir IMTP diagnostikai naudojami tyrimo metodai turi b  ti ne tik pakankamai jautr  s, bet ir pad  ti atskirti ant l ą steli   esan č ius fiziologinius antik  nus nuo patologini  . Iki iol daugelyje medicinos bei veterinarijos diagnostikos laboratorij   AIHA diagnozuoti naudojamas tiesiogin  s agliutinacijos metodas (DAT, dar vadinamas Coombs  metodu) aptinka tik 38-58 proc. AIHA atvej   (Melinda et al., 2000; Wilkerson et al., 2000). Tod  l io darbo vienas i tiksl   buvo parengti jautresnius AIHA tyrimo metodus: sustiprint ą  tiesiogin ę  agliutinacij ą  (eDAT) bei membranos imunofluorescencij ą  (MIF) su eritrocitais, naudojant plat   spektr ą   antik  n   prie uns  vairius imunoglobulinus bei tre č i ą j   komplemento komponent ą . Kadangi autoimunin  s citopenijos (AIHA/IMTP) danai sukelia komplikacijas ar diagnozuojamos kartu su kitomis ligomis, vienas i darbo tiksl  buvo isiaikinti cirkuliuojan č i  imunini  kompleks  (CICs) kiekio pakitimus AIHA/IMTP sergan č i  pacient  kraujyje.

 

5

Paskutinieji moksliniai tyrimai parod  , kad sergan č i    vairiomis v  io formomis un   serumuose yra mononuklearin  ms l ą stel  ms citotoksini   mediag   (Rösner, 2004). Du tre č daliai vis   tirt   v  iu sergan č i   un   serum   buvo citotoksiki pagrindin  ms efektorin  ms un   imunin  s sistemos l ą stel  ms. Kadangi beveik visuose min  tuose tyrimuose serumuose buvo aptikta autoantik  n   prie l ą steli    citoplazmos bei branduolio strukt  ras, iame darbe taip pat siek  me isiaikinti AIHA/IMTP sergan č i  un  serum  citotoksin  potencial ą .   Darbo tikslas   Nustatyti autoantik  nus ant un   eritrocit   bei trombocit   bei  vertinti nustatyt   autoantik  n   funkcin ę  reikm ę  AIHA/IMTP patogenezei.     Ikelti udaviniai   1.Parengti jautresnius AIHA diagnostinius metodus, naudojant polikloninius bei monokloninius antiserumus prie skirtingas un    imunoglobulin   klases bei j   poklasius ir komplemento tre č i ą j    komponent ą : a) sustiprint ą (modifikuot ą ) tiesiogin ę agliutinacij ą (eDAT); b) eritrocit  membranos imunofluorescencij ą . 2.Ianalizuoti Evans  sindromo dan   pacientams, kuriems ant eritrocit  ar trombocit  buvo nustatyti autoantik  nai. 3.Nustatyti cirkuliuojan č ius imuninius kompleksus AIHA/AITP sergan č i   pacient   serumuose ir  vertinti anemik   bei trombocitopenik   un   citotoksin   serum   poveik   uns leukocitams in vitro . 4.Charakterizuoti nespecifikai su uns eritrocitais bei trombocitais reaguojan č ius monokloninius antik  nus prie moni   leukocit    diferenciacijos antigenus (CD).   Naujumas ir praktin  reikm      iuo darbu mes  rod  me, jog membranos imunofluorescencijos (MIF) metodas yra daug jautresnis nei tiesiogin   agliutinacija (DAT ar Coombs ), aptinkant autoantik  nus ant eritrocit  . Pateikiame si  lym ą ,  6

kaip tiksliau ir aikiau vertinti bei interpretuoti MIF tyrimo su eritrocitais rezultatus. Iki i  dien    Evans sindromo (kai pacientui kartu diagnozuojama ir trombocitopenija, ir anemija) paplitimas tarp un  n  ra tiksliai nustatytas. M  s   tyrim   duomenimis, Evans sindromas ap  m   14,4% vis   d  l AIHA ir AITP tirt  pacient  . Naujum ą  iam darbui suteikia ir AIHA/AITP pacient  tyrimas d  l serumuose cirkuliuojan č i   imunini   kompleks   (CICs). Iki iol mokslin  je literat  roje n  ra duomen   apie pakitus   CICs kiek   AIHA ir AITP lig  atvejais. Netyrin  tas ir AIHA/AITP sergan č i  pacient  serum    citotoksinis potencialas, kuris gali daryti  tak ą uns leukocit  funkcijoms, o per juos  ir imuniniam organizmo atsakui  antigen ą . Pamin  ti nauji AIHA diagnoz  s bei AIHA/AITP patogenez  s aspektai n  ra b  dingi tik unims. Iki iol medicinoje esmini    diagnostikos bei patogenez  s skirtum  AIHA/AITP atvejais tarp moni    ir un  nepasteb  ta. Taigi ne tik daug jautresni diagnostikos metodai bei j   vertinimas ir interpretavimas, bet ir nauji duomenys apie CICs ir serum   citotoksikum ą  leis pateikti praktikams naujas min  t   lig    gydymo koncepcijas. Be jau min  t   darbo naujumo aspekt  , nustat  me, kad kai kurie monokloniniai antik  nai (CD42a, CD9, CD29, CD61, CD41/CD61, CD235) prie moni   CD reaguoja su un   trombocitais ir eritrocitais. Min  ti monokloniniai antik  nai gali b  ti panaudojami tolesniems eritrocit  ir trombocit   pavirini  strukt  r  tyrimams.   Darbo strukt  ra ir apimtis   Disertacij ą  sudaro  vadas, literat  ros apvalga, tyrim   ir metod    apraymas, gaut  rezultat  id  stymas, rezultat  apibendrinimas, ivados, publikacij   s ą raas, pad  ka asmenims, pad  jusiems perprasti tyrim    metodus bei vertinti ir interpretuoti duomenis, darbo santrauka. Darbe pateikiama: 25 lentel  s, 20 paveiksl  . Viso darbo apimtis  106 puslapiai. Darbe naudotasi 216 literat  ros altini  .   TYRIM  METODAI IR MEDIAGOS   Atliekant   darb ą d  l skirting  AIHA/AITP patogenez  s aspekt  i viso buvo tirti 5598 unys. Kraujas imtas i 1-14 m. amiaus un  :  7

69 proc. vis   tirt   un   sudar   patinai ir 31 proc.  patel  s. Kontrolini    grup ę  sudar   sveiki 2-14 m. amiaus unys (45 proc. patin   ir 55 proc. pateli  ).   Tirt  m  gini  skai č ius pagal darbe naudotus tyrimo metodus   Tiriamoji Kontrolin    Tyrimo pavadinimas grup  (n) grup  (n) Tiesiogin  agliutinacija (DAT arba Coombs ) 3881    tr M o e m m b b o r c a i n ta o i s s     imunofluorescencija (MIF) su  691 1 1488 Evans sindromo tyrimas 557 557 MIF su eritrocitais 24 13 DAT ir irykintos tiesiogin  s agliutinacijos (eDAT)  24 13 palyginimas Netiesiogin  s agliutinacijos ir MIF su eritrocitais palyginimas 9 5 Cirkuliuojantys imuniniai kompleksai (CICs) 18 8 Citotoksikumo (Methyl-Thiazol-Tetrazolium) tyrimas 27 11 MIF su eritrocitais ir monokloniniais antik  nais 31 42 s ir mon  ms specifikais m M o I n F  o s k u l   o er n i i t n r i o a c i i s t   a a i ntik  nais  5 I viso: 6262 2142                  

8

atimG-ul 1- L lol  c. F pro r  10 ne i ovub ejpret ;SCicen pmlU/ I00 11 00µ /glini ori tomicino ml  strep 1 sb lmk ,)oiru 6  10stląo uvx 2  ota kartkartdar  yTir .ą   n uaamsmun tadoocukles psus tit ajisneerpje (RPMI 164 0 us1  5mmlol  1- EP H, ES m18l mo  1 -lCHaN , 3 Omm 2 rintce i iaing muailV .ovailuga r in) i5 mig, 1 0 x1(08to iufug1  ().mlvtuuslim  nigslipityt aldiklylaikyti migan iS   remu o  samiou iliretS       . iel  rmruSe  evsai i( on saimtai praujas k k)nu ial   atyk cipatenr  ieisv artorej ,ok loks kambario tempe u   sn ianeirp (D) noiaG Ig+L(H tnkiniaininiaa o antik: triui eirp iankitna 

 

AIHA Tiesiogin  s agliutinacijos metodas (DAT arba Coombs ) AITP eritrocitai (RBCs) Membranos imunfluorescencijos metodas tro ( m M b I o F c ) i , tai Evans sindromas MIF su trombocitais + DAT su RBCs Cirkuliuojan č i    imunini  kompleks  metodas (CIC ) , serumo m  giniai

Sustiprinta DAT- Netiesiogin    DAT-MIF, RBCs MIF metodas Monokloniniai antik  nai, RBCs

  Kraujo m  giniai   Tirtas kraujas (2 ml m  gintuv  liuose su 120 μ l 15 proc. EDTA; Becton Dickinson, Vokietija) imtas i anemik  /trombocitopenik    pacient  . Kraujo m  giniai buvo atsi  sti   Imunologijos laboratorij ą   (Veterinarin  s medicinos mokykla, Hanoveris, Vokietija) itirti d  l autoimunin  s hemolitin  s anemijos ar trombocitopenijos.   Eritrocit  ruoimas tyrimams      Eritrocitai kelis kartus praplauti su izotoniniu fosfatiniu druskos buferiu (PBS, Seromed, Vokietija) (200 x g, 5 min). Po plovimo koncentruoti eritrocitai skiesti 1:40 terpe RPMI1640 (su 2 proc. inaktyvuotu fetaliniu verelio serumu (FCS), atskiestu 1:5 su PBS).  9

Citotoksikumo metodas (MTT) , serumo m  giniai

 

s un ,sV ruagaHbmav ,kos), otijaokie taen   A i  ikpt itionumbolgnilua su je (-100 ºC).    Atnkiniai  rerga    i,tym sps imunikificeolkilop  un nt eliląstoditn uan e ei skiestasujas praBP Sric 1 5:s  utauo(8s trenugifm 01 ,nix 00 ,g  01 rT   maiuo rtciboom arK     smamiryt s PBS. su  po  Jei otinyhopylzn s lrptas tcikoeurad siv re ovub itrocit, ankčiuam nit a retiortcial imin(lo szyrp )deco ar vlniutm gp tal dv20 mlta  piartnecnok sobugiteąs LS.PBs joci irufugto l s ectnx g, 10 os (400  radilek)nim ri la posutkas usrt t  lm 5ukil oira pmaaz. tainal 03s  il  niukke . krausi ąstejo l ilitotounav snedotbu 2osml0 is dkb lanaus i  ąt . Atstatyti drus )yz lnnitopohy( smamiryt sami ujo  krainioiferp retosatiur    C   otgu  asntcefuri 01( )lmigm syn min), pl g / 10 (   0100x           iog bkuu drupatoort cobm,ti   sveiko uns pamiotk arju onala  s,ainmujitvy okueL    . our tic ubuo   inku tat sčaaisip tnkisia  icaptne sun tna,it ut   a ro tocmbra tunts .S   aKkstoantikatant au  elortnok us sam itumet pao tu tyj vkinaotnginao ly buvimas td  uaktrsup ar Trombocit pale           4    .)C°  g x10, in m  ,  seatsaik lBP3 m    4 °      r prC) i ,g x 005,nim 01  staaupl(2S PBu  i palet ląstellasyv rialmzsod stie posioossks t ivičerC° 4D .) 2500os (guotrifuectnv li  rvltuing mtąki s otlekrep  ovub s