Blockadeeffekte von halogenierten Strukturanaloga des Anästhetikums Propofol an spannungskontrollierten Natriumkanälen [Elektronische Ressource] : erarbeitet mit der Hilfe der Patch-Clamp-Technik / Alexander Röder. Gertrud Haeseler. Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover
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Aus der Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover ________________________________________________________________________ Blockadeeffekte von halogenierten Strukturanaloga des Anästhetikums Propofol an spannungskontrollierten Natriumkanälen – erarbeitet mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover vorgelegt von Alexander Röder aus Hannover Hannover 2009 Angenommen von Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 01.12.2009 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Gertrud Haeseler Referent: Prof. Dr. med. Dirk Stichtenoth Korreferent: Prof. Dr. med. Christoph Fahlke Tag der mündlichen Prüfung: 01.12.2009 Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Hans-Anton Adams PD Dr. med. Makoto Nakamura Prof. Dr. med. Marius Hoeper INHALTSVERZEICHNIS Seite 1 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 3 2 PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 5 2.1 ERREGUNGSBILDUNG UND – WEITERLEITUNG 5 2.1.1 Das Ruhemembranpotential 5 2.1.2 Das Aktionspotential 7 2.1.3 Die Refraktärperiode 8 2.2 IONENKANÄLE 9 2.3 DER AUFBAU SPANNUNGSKONTROLLIERTER NATRIUMIONENKANÄLE 10 3 MATERIAL & METHODEN 13 3.
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| Publié le | 01 janvier 2010 |
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Aus der Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover ________________________________________________________________________
Blockadeeffekte von halogenierten Strukturanaloga des Anästhetikums Propofol an spannungskontrollierten Natriumkanälen erarbeitet mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Alexander Röder aus Hannover Hannover 2009
Angenommen von Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 01.12.2009 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Gertrud Haeseler Referent: Prof. Dr. med. Dirk Stichtenoth Korreferent: Prof. Dr. med. Christoph Fahlke Tag der mündlichen Prüfung: 01.12.2009 Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Hans-Anton Adams PD Dr. med. Makoto Nakamura Prof. Dr. med. Marius Hoeper
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INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHN S I 1 EINLEITUNG 3 2 PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 5 2.1 ERREGUNGSBILDUNG UND WEITERLEITUNG 5 2.1.1 Das Ruhemembranpotential 5 2.1.2 Das Aktionspotential 7 2.1.3 Die Refraktärperiode 8 2.2 IONENKANÄLE 9 2.3 DER AUFBAU SPANNUNGSKONTROLLIERTER NATRIUMIONENKANÄLE 10 3 MATERIAL & METHODEN 13 3.1 TESTSUBSTANZEN 13 3.2 VERWENDETE LÖSUNGEN 14 3.3 KANALEXPRESSION 15 3.4 TRANSFEKTION UND SELEKTION 15 3.5 ZELLKULTUR 16 3.6 PATCH-CLAMP-TECHNIK 17 3.6.1 Methode 17 36.2 Messstand 18 3.6.3 Pipetten 20 3.6.4 Durchführung eines Experimentes 21 3.7 DATENAQUISATION & -ANALYSE 22 3.7.1 Allgemeines Prinzip 22 3.7.2 Verwendete Pulsprogramme 23 3.7.2.1 Die Blockade des ruhend-aktivierbaren Natriumkanals ausgehend von verschiedenen Membranpotentialen [Resting-State-Affinity] 23 3.7.2.2 Ermittlung der Affinität zum schnell inaktivierten Natriumkanal [Fast inactivation] 25 3.7.2.3 Ermittlung der Affinität zum langsam inaktivierten Natriumkanal [Slow inactivation] 28 3.7.2.4 Effekt auf die Erholung des Natriumkanals nach schneller Inaktivierung [Recovery] 29 3.7.2.5 Frequenzabhängiger Block [Use-Dependent-Block] 30 3.7.3 Statistik- 32
INHALTSVERZEICHNIS 4 ERGEBNISSE 4.1 TESTSUBSTANZEN ZUM RUHEND-AKTIVIERBAREN DERDIE AFFINITÄT NATRIUMKANAL [RESTING-STATE-AFFINITY] 4.2DIE AFFINITÄT DER TESTSUBSTANZEN ZUM SCHNELL INAKTIVIERTEN NATRIUMKANAL [FAST INACTIVATION] 4.3DIE AFFINITÄT DER TESTSUBSTANZEN ZUM LANGSAM INAKTIVIERTEN NATRIUMKANAL [SLOW INACTIVATION] 4.4DER TESTSUBSTANZEN AUF DIE ERHOLUNG DESEFFEKT NATRIUMKANALS NACH SCHNELLER INAKTIVIERUNG [RECOVERY] 4.5FREQUENZABHÄNGIGER BLOCK [USE-DEPENDENT-BLOCK] 5 DISKUSSION 6 ZUSAMENFASSUNG 7 ABKÜRZUNGEN 8 DANKSAGUNG 9 LITERATURVERZEICHNIS 10 ANHANG
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1. EINLEITUNG Diese Arbeit befasst sich mit der Wirkung von halogenierten Propofolanaloga auf spannungskontrollierte skelettmuskuläre Natriumkanäle. Spannungsgesteuerte Natriumkanäle sind für die Zunahme der Natriumionenpermeabilität der Zellmembran während der Depolarisation zu Beginn eines Aktionspotentiales verantwortlich. Sie vermitteln die Erregbarkeit in Nerven- und Skelettmuskelgeweben. Natriumkanäle sind Zielstrukturen für natriumkanalblockierende Lokalanästhetika, Antiepileptika und Antiarrhythmika, welche mit zunehmender Depolarisation des Membranpotentials spannungsabhängig an Potenz gewinnen [Bean, 1983]. Der Gebrauch handelsüblicher Lokalanästhetika ist begrenzt durch einen durch diese Medikamentengruppe induzierten proarrythmogenen und prokonvulsiven Wirkungseffekt, der bei Gaben hoher Konzentrationen beobachtet wird. Ein potentieller Mechanismus ist dabei eine möglicherweise zugrunde liegende zentralnervöse Toxizität, bedingt durch eine Inhibition des Gamma-Amino-Butter-Säure-A-Rezeptors (GABAA), die bei in-vitro-Versuchen mit Lidocain, Bupivacain, Procain, Benzocain und Kokain beobachtet wurde [Hara, 1995; Ye, 1997; Sugimoto, 2000]. Ein Ziel der Entwicklung neuer lokalanästhetischer, antiarrhythmischer und antiepileptischer Medikamente ist das Erreichen einer Zunahme der natriumkanalblockierenden Eigenschaften unter Vermeidung pro-exzitatorischer Nebeneffekte [Krasowski, 2001; Trapani, 1998]. Es wurde bereits in vorausgegangenen Studien gezeigt, dass 2,6-Dimethylphenol, ein Strukturanalogum einerseits des Anästhetikums Propofol, andererseits des aromatischen Restes lidocainähnlicher Lokalanästhetika, Natriumkanäle mit gleicher Potenz blockiert wie Lidocain. Der durch 2,6-Dimethylphenol induzierte Natriumkanalblock ist spannungsabhängig, jedoch stellt sich ein Gleichgewicht der Bindung dieser Substanz an inaktivierte bzw. ruhende Kanäle schneller ein als bei Lidocain [Haeseler, 2002]. Verlängert man die Kettenlänge der Substituenten in der Ortho-Position von 2,6-Dimethylphenol zur phenolischen Hydroxylgruppe, indem man die Methylgruppen gegen Isopropylgruppen austauscht, entsteht 2,6-Diisopropylphenol (Propofol), was die Blockadepotenz dieser Verbindung unter Beibehaltung der Spannungsabhängigkeit und einer Reversibilität des Effektes um das 5-fache ansteigen lässt [Haeseler, 2001]. Werden große Terbutylgruppen anstelle der Isopropylgruppen (2,6-Diterbutyl-phenol) platziert, steigt die Potenz im Vergleich zum Propofol weiter an. Der Effekt ist allerdings kaum reversibel. Diese mangelhafte Auswaschbarkeit könnte ein Hinweis auf hydrophobe Interaktionen zwischen dem 2,6 Diterbutylphenol und seiner Bindungsstelle am Natriumkanal sein [Haeseler, 2003].
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Molekulare Modelling-Studien, bei denen verschiedene Analoga des Lokalanästhetikums Benzocain eingesetzt wurden, erbrachten die Hypothese, dass der substituierte Benzenring eine funktionell aktive Gruppe enthält, welche - die Ammoniumgruppe eines geladenen Lokalanästhetikums imitierend - imstande ist ein Natriumion zu binden und so die Interaktion mit den für die Lokalanästhetikabindung entscheidenden Aminosäureresten in der hydrophoben Kavität am Segment S6 der Domäne 4 des humanskelettmuskulären Natriumkanals zu bestimmen [Tikhonovet al., 2006; Godwinet al., 2005]. Daher könnten Phenolderivate und Benzocain-Analoga über die gleiche Lokalanästhetika-Bindungsstelle wirken. Es konnte mittels Modellbindungstudien mit Benzocain-Analoga gezeigt werden, dass eine Zunahme der Alkylierung die hydrophoben Interaktionen verstärkt und so die Bindung an den Lokalanästhetikarezeptor begünstigt [Godwinet al., 2005]. Da die Verlängerung der Seitenketten die Reversibilität der Natriumkanalblockade zu stark beeinträchtigt, wurde nach alternativen Wegen gesucht, die Potenz der Kanalblockade zu steigern. Basierend auf Resultaten einer vorausgegangenen Studie, die eine deutliche Potenzzunahme von Phenolderivaten bezüglich des Blockadeeffektes an spannungsgesteuerten Natriumkanälen offenbarte, wenn man ein Halogen in die Paraposition des Moleküls einbaute [Haeseler, 2001], wurden 3 verschiedene halogenierte Analoga des Anästhetikums Propofol synthetisiert: 4-Jodopropofol, 4-Bromopropofol und 4-Chloropropofol. Vorangegangene Ergebnisse haben gezeigt, dass diese Propofolanaloga Natriumeinwärtsströme in Ventrikelmyozyten der Ratte mit hoher Potenz blockieren [Brackenet al., 2006]. In der vorliegenden in-vitro-Studie zeigten alle drei Substanzen einen hoch-affinen Block depolarisationsinduzierter Natriumeinwärtsströme. Der Blockadeeffekt auf die Natriumströme war 20-mal stärker als der der Ausgangssubstanz Propofol und 100-mal stärker als der des Lokalanästhetikums Lidocain [Haeseler, 2001]. Die Wirkung setzte schnell ein (innerhalb von 60 Sekunden) und war im Auswasch reversibel. Die Resultate zeigen, dass halogenierte Propofolanaloga eine neue Klasse von Natriumkanalblockern mit einer sehr hohen Potenz darstellen.
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2. PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 2.1 ERREGUNGSBILDUNG UND WEITERLEITUNG 2.1.1 Das Ruhemembranpotential Als Ruhemembranpotential bezeichnet man eine an der Membran lebender Zellen messbare Potentialdifferenz zwischen Zellinnen- und Zellaußenseite. Bei Muskel- und Nervenzellen beträgt das Ruhemembranpotential je nach Zelltyp -50 bis -100 mV, [Silbernagl & Despopoulos, 1991], wobei das Zellinnere eine negative Ladung, basierend auf einer ungleichen Ionenverteilung, trägt. Folgende Mechanismen erhalten das Ruhemembranpotential aufrecht: 1.) Unter Ruhebedingungen ist die Zellmembran für Kalium gut permeabel, so dass Kalium-Ionen entlang des Konzentrationsgefälles von dem Intrazellulärraum in den Extrazellulärraum diffundieren. Aufgrund des Ausstromes der positiv geladenen Kaliumionen entsteht an der Membraninnenseite ein negatives Potential. Dadurch wird der Ausstrom zunehmend behindert. Auch für Chloridionen ist die Zellmembran gut durchlässig. Diese diffundieren aufgrund des elektrischen Gradienten, aber entgegen ihres chemischen Gradienten aus der Zelle heraus. Es stellt sich sowohl für die Diffusion der Kaliumionen als auch für die Diffusion der Chloridionen ein Gleichgewichtspotential ein, welches durch dieNernstsche Gleichung beschrieben wird: Ex= [(R∙T) / (F∙zx)] ∙ ln ([x]a/ [x]i), wobei E das Gleichgewichtspotential darstellt, das sich für das Ion x“ zwischen der Innenseite (i) und der Außenseite (a) der Zellmembran einstellt. R symbolisiert die allgemeine Gaskonstante, T die absolute Temperatur, F die Faraday-Konstante, zx die Ladungszahl und [x] die Konzentration des Ions x an der Außen- bzw. Innenseite der Membran [Silbernagl & Despopoulos, 1991]. Das Ruhemembranpotential liegt in der Nähe des Kalium- bzw. Chlorid-Gleichgewichtspotentials und wird daher stark von der extrazellulären Kaliumkonzentration bestimmt.
2.) Die Zellmembran ist für anionische Proteine und Phosphate nur wenig permeabel.
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3.) Die Na+.-K+.-ATPase pumpt laufend Natrium aus der Zelle heraus und Kalium in die Zelle hinein. 4.) Unter Ruhebedingungen ist die Zellmembran für Natrium nur wenig durchlässig, so dass der Natriumkonzentrationsausgleich durch passive Rückdiffusion behindert ist. 2.1.2 Das Aktionspotential Ein Aktionspotential ist die Antwort einer erregbaren Nerven- oder Muskelzelle auf einen Reiz, der mechanischer, chemischer oder elektrischer Natur sein kann, mit Änderung der Ionenleitfähigkeit und des Membranpotentials. Das Aktionspotential der durch einen Reiz in Aktion“ versetzten Zelle lässt sich zeitlich in drei Phasen unterteilen:
1. Schnelle Depolarisation und Potentialumkehr 2. Langsame Repolarisation 3. Nachhyperpolarisation
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Aktionspotentials mit Veränderung der Natrium-, bzw. Kalium-Leitfähigkeit, in der die drei Phasen der schnellen DepolarisationD, der langsamen RepolarisationR der Nachhyperpolarisation undN aufgezeigt werden. [Abb. nach Silbernagl & Despopoulos, 1991]
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Übersteigt eine durch einen Reiz verursachte Vordepolarisation einen gewissen Schwellenwert an der Membran einer erregbaren Zelle, reagiert diese mit monotonen Potentialantworten, den Aktionspotentialen. Diese resultieren aus einer zeit- und potentialabhängigen Veränderung der Membranleitfähigkeit für bestimmte Ionen. Im Ruhezustand einer Zelle dominiert die Leitfähigkeit für Kalium-Ionen in der Membran, so dass das Ruhemembranpotential (70 mV) in der Nähe des Kalium-Gleichgewichtspotentials liegt [Hodgkin and Horowicz, 1959]. Bei Erreichen des Schwellenwertes kommt es zur Öffnung von Natriumkanälen und damit zu einer raschen Depolarisation und Potentialumkehr, da das Gleichgewichtspotential von Natrium bei ungefähr +60 mV liegt. Dieses wird jedoch nicht erreicht. Bereits innerhalb einer Millisekunde gehen die Natriumkanäle spontan in einen inaktiven Zustand über. Die Repolarisation und die Nachhyperpolarisation, bei der kurzzeitig negativere Spannungswerte als während des Ruhemembranpotentials erreicht werden, erfolgen über die verzögert einsetzende Zunahme der Kaliumleitfähigkeit. Abläufe von Aktionspotentialen sind monoton bzw. stereotyp, das heißt, dass sie für eine bestimmte Zellart, beispielsweise Skelettmuskelzellen, nach Erreichen des Schwellenwertes immer gleich ablaufen. Wird der Schwellenwert nicht erreicht, unterbleibt das Aktionspotential ganz. Aktionspotentiale folgen dem Alles-oder-nichts-Gesetz“ [Klinke & Silbernagl, 1994; Dudel, 2000]. Aufgabe einer Nervenfaser ist es, Informationen oder Steuerimpulse in Form von Erregungen weiter zu leiten. Die Erregungsübertragung von einem motorischen Neuron auf eine Skelettmuskelfaser findet an der motorischen Endplatte mittels des Neurotransmitters Acetylcholin statt. Die Membran einer Muskelfaser leitet Erregungen weiter, indem bereits depolarisierte Membrananteile bei benachbarten, noch ruhenden“ Membranabschnitten ebenfalls eine Depolarisation erzeugen. Die Amplitude des Aktionspotentials ist an allen Membranabschnitten gleich groß. Das Aktionspotential findet mit zunehmendem Abstand zum Ursprungsreiz mit proportional zunehmender Verzögerung statt [Dudel, 2000]. Spannungskontrollierte Natriumkanäle des Sarkolems sind für die Ein- und Weiterleitung des Aktionspotentials an der Muskeloberfläche verantwortlich und spielen daher eine entscheidende Rolle bei der Muskelerregbarkeit. Das fortgeleitete Aktionspotential mündet als Ende einer Reaktionskette, an der weitere Ionenkanäle, wie zum Beispiel ligandenkontrollierte Kalziumkanäle beteiligt sind, in einer Kalziumfreisetzung
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aus Kalziumspeichern des sarkoplasmatischen Retikulums der erregten Muskelzelle. Durch die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration wird über die elektromechanische Kopplung eine Verbindung der Myofilamente Aktin und Myosin, und so die Muskelkontraktion ermöglicht. Um den korrekten Ablauf solcher Vorgänge zu gewährleisten, ist eine präzise Steuerung des Schaltverhaltens der Ionenkanäle, das so genannte Gating“, welches das Öffnen und Schließen der Kanalproteine regelt, erforderlich. Bei der Fortleitung des Aktionspotentials wird das Schaltverhalten der Natriumkanäle durch die Membranspannung über spezifische Konformationsänderungen der am Gating beteiligten Kanalproteine kontrolliert [Lercheet al., 2000]. 2.1.3 Die Refraktärperiode Unmittelbar nach der Depolarisationsphase eines Aktionspotentials schließt sich eine kurze Zeitspanne an, in der Nerv oder Muskel auch durch starke Reize nicht erregbar sind. Diese wird als absolute Refraktärperiode“ bezeichnet. Ihr schließt sich eine relative Refraktärperiode an, in der nur ein Aktionspotential geringerer Höhe und Anstiegssteilheit ausgelöst werden kann. Wenn das Membranpotential wieder seinen Ruhewert erreicht hat, kehren diese Größen wieder zu ihrem normalen Wert zurück [Silbernagl & Despopoulos, 1991]. Die während der Depolarisationsphase des Aktionspotentials inaktivierten Natriumkanäle benötigen eine definierte Zeit der Membranrepolarisation, um sich von der Inaktivierung zu erholen (Recovery).
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2.2 IONENKANÄLE Die aus einer Lipiddoppelschicht bestehende Zellmembran trennt das Zytoplasma vom Extrazellulärraum. Um eine Verbindung zwischen Extra- und Intrazellulärmilieu zu gewährleisten, befinden sich unter anderem Kanalproteine in der Zellmembran, die hydrophile Poren mit einer Selektivität für bestimmte anorganische Ionen aufweisen. Ihre Aufgabe besteht darin, dem für sie spezifischen Ion eine schnelle Diffusion durch die Doppellipidmembran entlang eines elektrochemischen Gradienten zu ermöglichen. Zwei wichtige Eigenschaften unterscheiden Ionenkanäle von anderen membranständigen, kanalbildenden und mit Wasser gefüllten Poren [Hille, 1992]: 1. Ionenkanäle besitzen eine Ionenselektivität, die bestimmten Ionen einen Durchtritt erlaubt, anderen Ionen aber nicht. 2. Ionenkanäle sind im Unterschied zu einfachen, wassergefüllten Poren nicht ständig geöffnet. Ionenkanäle besitzen Rezeptoren, die auf entsprechende Reize ein kurzes Öffnen ihrer Kanäle veranlassen, bevor diese sich wieder schließen. Sie sind zumeist liganden- oder spannungskontrolliert [Albertset al.1989]. Ionenkanäle bilden die Grundlage der elektrischen, Erregbarkeit von Nerven- und Muskelzellen sowie der integrativen Funktion von Neuronen. In der Initialphase eines Aktionspotentiales sind spannungskontrollierte Natriumkanäle wesentlich für die schnelle Depolarisation verantwortlich. Sie werden durch Änderung des Membranpotentials (Depolarisation) aktiviert [Hodgkin, 1952, 1964; Katz, 1962; Hille, 1986].
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