C/EBPbeta deltauORF mice - a genetic model for uORF-mediated translational control in mammals [Elektronische Ressource] / Klaus Wethmar. Gutachter: Achim Leutz ; Claus Scheidereit ; Thomas Sommer

Klaus Wethmar

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• Biologie

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 19
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 11 Mo

Extrait

Aus dem Max-Delbrück-Centrum für molekulare Medizin
uORF
C/EBP mice – a genetic model for uORF-mediated
translational control in mammals
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dr. med. Klaus Wethmar
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Andreas Herrmann

Gutachter: 1. Prof. Dr. Achim Leutz
2. Prof. Dr. Claus Scheidereit
3. Prof. Dr. Thomas Sommer
Tag der mündlichen Prüfung: 28. März 2011


Table of contents
Table of contents 2
Zusammenfassung 4
Abstract 5
Dedication 7
List of abbreviations 8
1 Introduction 11
1.1 Translational regulation of protein expression 11
1.1.1 Mechanisms of translational control 11
1.1.2 Translational control by upstream open reading frames 14
1.1.2.1 Variable presence of uORFs in alternative transcripts 15
1.1.2.2 Length, position and initiation codon context 15
1.1.2.3 Upstream ORFs integrate the general translational status of a cell 17
1.1.2.4 Upstream ORF-encoded peptides 18
1.1.2.5 Nonsense-mediated mRNA decay 19
1.1.2.6 Variables affecting the degree of uORF-mediated MCS repression 20
1.2 CCAAT/enhancer binding proteins 21
1.2.1 Family overview 21
1.2.2 Isoform-specific functions of C/EBP transcription factors 24
1.2.3 Upstream ORF-mediated control of C/EBP isoform expression 26
1.3 Aims of the thesis 29
2 Materials and Methods 31
2.1 Mice 31
uORF WT2.1.1 Generation of C/EBP and C/EBP mice 31
2.1.2 Genotyping 32
2.1.3 Peripheral blood glucose test 33
2.1.4 Whole mount staining of mouse mammary glands 33
2.1.5 Blood counts 33
2.1.6 Fluorescence activated cell sorting (FACS) 34
2.1.7 Mouse lipopolysaccharid treatment 35
2.1.8 Mouse embryonic fibroblast (MEF) preparation and proliferation assay 35
2.1.9 Osteoclast cultures and TRACP staining 35
2.1.10 Bone histology and histomorphometry 36
2.1.11 Partial hepatectomy and BrdU labeling 36
2.1.12 Liver histomorphometry 37
2.2 Protein analysis 37
2.2.1 Cell lysis, tissue lysis and immunoblotting 37
2.2.2 Enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) 39
2.3 RNA analysis 39
2.3.1 Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) 39
2.3.2 Microarray expression analysis 41

2
Table of contents
2.4 Various methods 41
2.4.1 Chromatin immunoprecipitation 41
2.4.2 Luciferase reporter assays 43
2.4.3 Statistical analysis 45
3 Results 47
uORF 3.1 Basic characterization of C/EBPmice 47
uORF3.2 Loss of uORF-mediated LIP expression in C/EBP mice 51
3.3 Defective osteoclast differentiation and altered bone homeostasis in
uORFC/EBP mice 53
uORF3.4 Superactivated acute phase gene expression in C/EBP mice 56
uORF3.5 Proliferative defects during liver regeneration in C/EBP mice 58
3.6 Isoform-specific co-regulation of E2F-controlled cell cycle genes 62
4 Discussion 65
4.1 Proof of principle: uORF-mediated translational control in the mouse 65
4.2 C/EBP translational control – exception or paradigm? 66
4.2.1 Mechanisms of uORF-mediated translational control of C/EBP 68
4.3 Do uORFs control the translation of C/EBP? 71
4.4 Physiological relevance of the C/EBP isoform expression ratio 72
4.4.1 LAP and LIP opposingly regulate the differentiation of osteoclasts 73
4.4.2 Increased C/EBP LAP over LIP isoform ratio alters acute phase response
gene expression 75
4.4.3 Isoform-specific cell cycle regulation by C/EBPs 78
4.4.4 The function of C/EBP isoforms during liver regeneration 80
4.5 Concluding remarks and future directions 82
4.5.1 Resolving the bipartite functions of C/EBP transcription factors 82
4.5.2 Defining the role of uORFs in the etiology of disease 84
Supplement 87
Acknowledgements 105
References 106
Erklärung 117
Publikationsliste 118

3

Zusammenfassung
Evolutionär konservierte, kleine offene Leserahmen (upstream open reading frames, uORFs)
sind translational aktive Kontrollelemente, die bevorzugt in Boten-Ribonukleinsäuren von
Schlüsselgenen zur Regulation von Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung anzutref-
fen sind. Man nimmt an, dass uORFs die Proteinexpression von betroffenen Transkripten
durch die Regulierung der ribosomalen Reinitiation an 3´ gelegenen alternativen Initiations-
codons kontrollieren. Obwohl die physiologische Relevanz uORF-vermittelter translationaler
Kontrolle durch humangenetische Studien nahe gelegt wird, existiert bislang kein experimen-
telles Wirbeltiermodel, das diese Vermutung belegt.
In dieser Arbeit wurden Mäuse analysiert, die defizient für das uORF Initiationscodon des
uORFTranskriptionsfaktors CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP ) sind. Protein-
uORFanalysen verschiedener Gewebe zeigten, dass C/EBP Mäuse im Gegensatz zu Wildtyp-
tieren nicht in der Lage sind, die kurze, auto-antagonistische C/EBP LIP Isoform zu induzie-
ren. Die verminderte LIP Expression verursachte eine gestörte Differenzierung knochen-
abbauender Osteoklasten und ging mit einer Zunahme von mineralisiertem Knochengewebe
uORF Mäusen einher. Nach partieller Hepatektomie führte der Verlust der uORF-in C/EBP
uORFvermittelten Induktion von LIP in regenerierenden C/EBP Lebern zu einer Überaktivie-
rung C/EBP -regulierter Akute Phase Gene. Im Vergleich zum Wildtyp wiesen Hepatozyten
uORFvon C/EBP Tieren zudem einen verzögerten und abgeschwächten Wiedereintritt in die
S-Phase des Zellzyklus auf. Genomweite Genexpressionsanalysen zeigten, dass die vermin-
uORFderte S-Phase Aktivität in regenerierenden C/EBP Lebern mit einer persistierenden
Repression von Zellzyklusgenen korrelierte, wobei insbesondere die verminderte Expression
zahlreicher E2F-regulierter Gene auffällig wurde. Chromatinimmunpräzipitations- und Repor-
tergenexperimente führten zur Entwicklung eines mechanistischen Modells, das eine iso-
formspezifische C/EBP -Koregulation E2F-kontrollierter Zellzyklusgene vorschlägt.
uORFDie Analyse der C/EBP Mäuse belegt erstmals die Funktionalität der uORF-gesteuerten
translationalen Kontrolle im Säugetier. Zusammen mit Sequenzanalysen, welche die weite
Verbreitung von uORFs im menschlichen Transkriptom belegen, weisen die hier vorgestellten
experimentellen Daten auf eine entscheidende Bedeutung dieses Kontrollmechanismus bei
zahlreichen physiologischen und pathopysiologischen Prozessen hin.

4

Abstract
Evolutionary conserved small upstream open reading frames (uORFs) are translational control
elements predominantly prevalent in the 5’ mRNA regions of key regulatory genes of growth,
proliferation, and differentiation. Small uORFs are considered to regulate protein expression
by controlling translation re-initiation at downstream initiation codons. Although the physio-
logical relevance of uORF-mediated translational control is implied by human genetic studies,
no experimental vertebrate model exists to prove this assumption.
This thesis comprises the evaluation of mice deficient for the uORF initiation codon of the
uORFtranscription factor CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP ). Protein analysis of
uORFvarious tissues demonstrated that C/EBP mice, in contrast to wildtype control animals
WT(C/EBP ), fail to induce translation of the truncated, auto-antagonistic C/EBP LIP iso-
form. The reduced expression of LIP was associated with impaired differentiation of bone
uORFresorbing osteclasts and resulted in an increased bone volume of C/EBP mice. After
partial hepatectomy the loss of uORF-mediated LIP induction resulted in super activation of
uORFacute phase response genes in regenerating livers. Furthermore, C/EBP hepatocytes
showed a delayed and blunted re-entry into the cell cycle after partial hepatectomy as com-
WTpared to C/EBP animals. Genome-wide transcript expression analyses revealed that the
uORFreduced S-phase activity in regenerating C/EBP livers correlated with a persistent re-
pression of cell cycle regulatory genes and showed a remarkable underrepresentation of genes
regulated by the E2F family of transcription factors. Chromatinimmunoprecipitations and
luciferase reporter gene assays allowed the development of a mechanistic model that suggests
C/EBP isoform-specific co-regulation of E2F-controled cell cycle genes.
uORF mice validates the functionality of uORF-mediated translational The analysis of C/EBP
control in vertebrates. Together with sequence analyses that demonstrate the widespread
prevalence of uORFs in the human transcriptome, the experimental data presented in this the-
sis suggest a comprehensive role of uORF regulation in physiology and the etiology of dis-
ease.

5

Dedication
for Anne, Klaus, Christine and Lauren.

7 1List of abbreviations
°C degree Celsius
A adenosine
AML acute myeloid leukemia
APR acute phase response
APS ammonium persulph