Characterisation of bacteriophage-derived tailspike and tail fibre proteins [Elektronische Ressource] / von David Schwarzer

David Schwarzer

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 40
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

Characterisation of Bacteriophage-derived
Tailspike and Tail Fibre Proteins



Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.


genehmigte Dissertation
von


Dipl.-Biochem. David Schwarzer
geboren am 16. Juli 1977 in Peine



2008




Referentin: Prof. Dr. Rita Gerardy-Schahn
Korreferent: Prof. Dr. Ralf Ficner
Tag der Promotion: Mittwoch, 06.02.2008; 15:00 Uhr




















Schlagworte: Endosialidasen, Bakteriophagen, Polysialinsäure
Key words: endosialidases, bacteriophages, polysialic acid

















„Schläft ein Lied in allen Dingen,
Die da träumen fort und fort,
Und die Welt hebt an zu singen,
Triffst du nur das Zauberwort.“
Joseph Freiherr von Eichendorff (1788-1857)

Dissertation David Schwarzer Table of Contents


Table of Contents
Chapter 1 – Zusammenfassung....................................................................................................1
Chapter 2 – Abstract.....................................................................................................................2
Chapter 3 – General Introduction ...............................................................................................3
3.1 – Bacteriophages...................................................................................................... 3
3.1.1 – Tailed Bacteriophages – the Order of Caudovirales........................................... 3
3.1.2 – Life Cycle of Bacteriophages and Pathogenicity ................................................ 6
3.1.3 – Evolution of Bacteriophages............................................................................... 6
3.1.4 – Tailspike and Tail Fibre Proteins ........................................................................ 7
3.2 – Escherichia coli K1 and Polysialic Acid.............................................................. 8
3.3 – Anti-K1 Bacteriophages and Endosialidases...................................................... 9
3.4 – Crystal Structure of Endosialidase F................................................................ 13
3.5 – Biological and Biomedical Applications of Endosialidases............................. 15
3.6 – Objectives ............................................................................................................ 16
Chapter 4 – Evolution of Bacteriophages Infecting Encapsulated Bacteria: Lessons
from Escherichia Coli K1 Specific Phages ...........................................................17
4.1 – Supplemental Material....................................................................................... 31
Chapter 5 – Characterization of a Novel Intramolecular Chaperone Domain
Conserved in Endosialidases and Other Bacteriophage Tailspike and
Fibre Proteins .........................................................................................................34
5.1 – Supplemental Material 47
Chapter 6 – Proteolytic Maturation of Endosialidase F Is Essential to Allow
Efficient Binding to Polysialic Acid......................................................................48
Chapter 7 – Synthesis and Biological Evaluation of a New Polysialic Acid Hydrogel
as Enzymatically Degradable Scaffold Material for Tissue
Engineering.............................................................................................................67
7.1 – Supplemental Material....................................................................................... 81
Chapter 8 – General Discussion.................................................................................................83
8.1 – Evolution of Escherichia coli K1 specific Bacteriophages............................... 83
8.2 – Characterisation of the C-terminal Chaperone Domain of
Endosialidases..................................................................................................... 84
8.3 – The Potential of Endosialidases in Medical Applications ............................... 90
Chapter 9 – References...............................................................................................................91
Appendix 1 – Abbreviations..98
Appendix 2 – Curriculum Vitae and Publications ...................................................................99
Appendix 3 – Danksagungen....................................................................................................102

Page i Dissertation David Schwarzer Chapter 1 – Zusammenfassung


Chapter 1 – Zusammenfassung
Ein gemeinsames Hauptmerkmal von Bakteriophagen, die Escherichia coli K1 infizieren, sind ihre
tailspike Proteine, die Endosialidasen. Diese Enzyme, über die K1-Phagen ihren Wirt spezifisch
erkennen, geben ihnen gleichzeitig die Fähigkeit, die dichte bakterielle Kapsel, die aus α2,8-
verknüpfter Polysialinsäure besteht, abzubauen und so den Infektionszyklus einzuleiten. In der
vorliegenden Arbeit wurden drei Ziele verfolgt: (i) die Untersuchung der Evolution K1-spezifischer
Phagen, (ii) die Eigenschaften zu definieren, welche die ungewöhnlich hohe Stabilität und Spezifität
der Polysialinsäure degradierenden Enzyme bedingen und (iii) die Charakterisierung der Fähigkeit
der Endosialidasen in Bezug auf den Abbau chemisch modifizierter Polysialinsäure.
Die Evolution K1-spezifischer Phagen wurde in einer vergleichenden Genomanalyse der lytischen
Phagen K1E und K1F sowie des temperenten anti-K1 Phagen CUS-3 untersucht. In dieser ersten
Studie konnte gezeigt werden, dass K1-Phagen nicht aus einem einzigen Vorläufer entstanden sind,
sondern enge Verwandtschaft zu unterschiedlichen Vorläuferphagen aufweisen. Es wurde gezeigt,
dass die Wirtsspezifität für Escherichia coli K1 hauptsächlich durch lateralen Transfer des
Endosialidase-Gens erworben wurde.
Die funktionelle Faltung und Oligomerisierung der Endosialidasen hängt essentiell von der Präsenz
einer kurzen C-terminalen Domäne (CTD) ab, die im Verlaufe der Proteinreifung abgespalten wird.
Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte eine homologe CTD in weiteren Phagenproteinen identifiziert
werden, die zu drei unterschiedlichen Proteinfamilien gehören: die neck appendage Proteine
verschiedener Bacillusphagen, die L-shaped tail fibre Proteine des Coliphagen T5, sowie
verschiedene K5-Lyasen, die tailspike Proteine von Escherichia coli K5 infizierenden Phagen. Um
die Bedeutung der CTD für die Faltung und Funktion dieser Proteine zu untersuchen, wurde ein
Vertreter jeder Familie ausgewählt und einer Struktur- und Funktionsanalyse unterzogen. Diese
führte zu dem Ergebnis, dass (i) die CTD eine eigenständige Domäne mit hohem Anteil an
α-helikalen Strukturen darstellt; (ii) die proteolytische Freisetzung durch Spaltung an einem hoch
konservierten Serinrest erfolgt und der Austausch dieses Restes gegen Alanin die Spaltung
verhindert; (iii) die isolierten C-terminalen Domänen zu Hexameren assemblieren; (iv) hoch
konservierte Aminosäurereste innerhalb der CTD essentiell für die Faltung und Komplexbildung der
Trägermoleküle sind und (v) die CTD zwischen Proteinen der oben genannten Proteinfamilien
ausgetauscht werden kann. Somit konnte die CTD als intramolekulare Chaperon-Domäne
identifiziert werden. Ein Vergleich der thermischen Stabilität von ungespaltenen und proteolytisch
prozessierten Endosialidase-Varianten deutete darauf hin, dass die Freisetzung der CTD die
Entfaltungs-Energiebarriere des Enzymkomplexes erhöht, wodurch das prozessierte Trimer in einer
kinetisch stabilen Konformation gehalten wird.
Zusätzlich konnte in einer dritten Studie gezeigt werden, dass die proteolytische Spaltung von
Endosialidasen auch direkt die Interaktion mit Polysialinsäure beeinflusst, da das Vorhandensein der
CTD die Substratbindung vermindert.
Der letzte Teil dieser Studie unterstreicht das biotechnologische Potential von bakteriophagen-
assoziierten tailspike Proteinen, wiederum am Beispiel von Endosialidasen. Hier konnte gezeigt
werden, dass Hydrogele aus quervernetzter Polysialinsäure mit Hilfe von Endosialidasen kontrolliert
abgebaut werden können. Diese neuartigen, synthetischen und unlöslichen Materialien könnten als
biodegradierbare Gerüste in neuroregenerativen Anwendungen zum Einsatz kommen.
Page 1 Dissertation David Schwarzer Chapter 2 – Abstract


Chapter 2 – Abstract
Bacteriophages infecting Escherichia coli K1 share one common feature, represented by the
endosialidase tailspike proteins. These enzymes allow the K1-phages to specifically bind to and
cleave the capsular polysaccharide of the host bacterium composed of α2,8-linked polysialic acid.
The present work was focussed on: (i) the evolution of K1-specific phages, (ii) the unusual stability
and specificity of the polysi