Development and application of a quantitative analysis method for fluorescence resonance energy transfer localization experiments [Elektronische Ressource] : Bayesian inference of macromolecule structures / Adam Muschielok. Betreuer: Jens Michaelis

Adam Marek Muschielok

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Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät Chemie derLudwig-Maximilians-Universität MünchenDevelopment and Applicationof a Quantitative Analysis Method forFluorescence Resonance Energy TransferLocalization ExperimentsBayesian Inference of Macromolecule StructuresAdam Marek MuschielokausPyskowice / Peiskretscham, PolenMünchen 2011&ISFOX?SUMJDIF7FSTJDIFSVOHDie Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet überabrufbar.ISBN 978-3-86853-982-0Diese Dissertation wurde im Sinne von § 13 Abs. 3 der Promotionsordnung vom29. Januar 1998 (in der Fassung der vierten Änderungssatzung vom 26. November 2004)von Herrn Prof. Dr. Jens Michaelis betreut.Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.München, den 23. November 2010Adam MuschielokDissertation eingereicht am: 23. November 20101. Gutachter: Prof. Dr. Jens Michaelis2. Gutachter: Prof. Don C. Lamb, Ph.D.Mündliche Prüfung am: 16. Dezember 2010© Verlag Dr. Hut, München 2011Sternstr. 18, 80538 MünchenTel.: 089/66060798Alle Rechte, auch die des auszugsweisen Nachdrucks, der Vervielfältigung und Verbreitung in besonderen Verfahren wie fotomechanischer Nachdruck, Fotokopie, Mikrokopie, elektronische Datenaufzeichnung einschließlich Speicherung und Übertragung auf weitere Datenträger sowie Übersetzung in andere Sprachen, behält sich der Autor vor.1.

Sujets

• Physik

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• Publié le: 01 janvier 2011
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Extrait

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät Chemie der
Ludwig-Maximilians-Universität München
Development and Application
of a Quantitative Analysis Method for
Fluorescence Resonance Energy Transfer
Localization Experiments
Bayesian Inference of Macromolecule Structures
Adam Marek Muschielok
aus
Pyskowice / Peiskretscham, Polen
München 2011Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über
abrufbar.
ISBN 978-3-86853-982-0
Diese Dissertation wurde im Sinne von § 13 Abs. 3 der Promotionsordnung vom
29. Januar 1998 (in der Fassung der vierten Änderungssatzung vom 26. November 2004)
von Herrn Prof. Dr. Jens Michaelis betreut.
Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.
München, den 23. November 2010
Adam Muschielok
Dissertation eingereicht am: 23. November 2010
1. Gutachter: Prof. Dr. Jens Michaelis
2. Gutachter: Prof. Don C. Lamb, Ph.D.
Mündliche Prüfung am: 16. Dezember 2010
© Verlag Dr. Hut, München 2011
Sternstr. 18, 80538 München
Tel.: [phone]
Alle Rechte, auch die des auszugsweisen Nachdrucks, der Vervielfältigung und Verbreitung in besonderen Verfahren wie
fotomechanischer Nachdruck, Fotokopie, Mikrokopie, elektronische Datenaufzeichnung einschließlich Speicherung und
Übertragung auf weitere Datenträger sowie Übersetzung in andere Sprachen, behält sich der Autor vor.
1. Auflage 2011
&ISFOX?SUMJDIF7FSTJDIFSVOH
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IUUQEOCEOCEF
TDIF*OGPSNBUJPOEFS%FVUTDIFO/BUJPOBMCJCMJPUIFL #JCMJPHSBpAbstract
This thesis focuses on the Bayesian data analysis of single-molecule fluorescence reso-
nance energy transfer (FRET) experiments carried out to infer structural information of
biological macromolecules and macromolecular complexes labeled with fluorophores.
In general, the measurement of FRET efficiencies allows to determine the distance
of two fluorophores quantitatively and thus acts as a molecular ruler on the nanometer
length scale. Moreover, it is possible to calculate the yet unknown position of one or more
fluorophores relative to each other by trilateration. In doing so, FRET efficiency measure-
ments between the fluorophore to be localized, called antenna, and several fluorophores at
known locations, called satellites, are used to constrain the position of the antenna. This,
in turn, can be used to answer questions in structural biochemistry, when the antennas are
attached for example to a yet unlocalized constituent of a macromolecular complex, while
the satellites are linked to positions known from e.g. X-ray crystallography experiments.
However, FRET efficiency depends not only on the fluorophore separation but also
on the orientation of the transition dipole moments of the fluorophores. This makes a
simple conversion of FRET efficiencies into distances inapplicable, as the orientations are
usually unknown. Although these orientation effects were known to be a major source
of uncertainty in FRET-based localization experiments, they have often been ignored or
argued away in the literature.
The main result of this thesis is a novel data analysis tool, which was developed in order
to account for both distance and orientation effects and thus allowing an accurate FRET-
based localization. This tool was called Nano-Positioning System (NPS) and applies
Bayesian data analysis to infer possible positions of fluorophores and optionally also the
positions and orientations of the subunits of a macromolecular complex.
The results of NPS can be readily displayed in the form of probability densities that
reflect the information about the position of a fluorophore or a particular subunit in
a macromolecular complex. The location, form and fuzziness of the densities impart
simultaneously the position and the uncertainty of localization. Shown together with an
already known macromolecule structure, these densities can then be interpreted in an
intuitive way.
NPS was successfully tested by localizing a fluorophore attached to a known position
in yeast RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes (ECs). To demonstrate the
practical value of NPS, it was applied to study the influence of the transcription factor
IIB (TFIIB) on the position of the nascent RNA as well as to map the pathway of the
nontemplate and upstream DNA in yeast Pol II ECs. Furthermore, the position and ori-
entation of the TATA binding protein (TBP) in initial transcribing complexes of Pol II
were inferred. A deeper understanding of NPS was obtained by analyzing synthetic data.
Unknown fluorophore orientations were found to be indeed the major source of localiza-
tion uncertainty under commonly encountered experimental conditions. Synergy effects
emerging from the simultaneous analysis of a FRET network containing several antenna
and satellite fluorophores were observed to improve the accuracy of the inference. It is
proposed to use FRET anisotropy data in addition to the commonly measured FRET effi-
ciencies to calculate accurate fluorophore orientations and thus dramatically increase the
localization accuracy of NPS. Finally, general aspects of NPS are discussed and possible
future improvements of NPS are pointed out.
iiiContents
Abstract iii
1 Introduction 1
2 Basics 3
2.1 Fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.1.1 Physical model of fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.1.2 Time-dependent fluorescence decay . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.1.3 Fluorescence polarization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.1.4 anisotropy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2.1 Physical model of FRET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2.2 Definition of FRET efficiency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.3 of anisotropy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2.4 Measurement of FRET efficiency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3 FRET in labeled macromolecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.3.1 Fluorescence anisotropy of a macromolecule-bound fluorophore . . 10
2.3.2 Influence of segmental motion on the FRET efficiency and anisotropy 11
2.4 Probabilistic data analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.4.1 Probability calculus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.4.2 Bayesian parameter estimation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.4.3 Assignment of priors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.4.4 Characterization of continuous probability distributions . . . . . . 20
2.4.5 Bayesian model selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4.6 Application to real problems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.5 Sampling from probability densities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.5.1 Markov chain Monte Carlo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.5.2 Nested sampling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3 Development of the Nano-Positioning System 35
3.1 The position-Försterdistance model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.1.1 Model assumptions and parametrization . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.1.2 Likelihood . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.1.3 Prior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.1.4 Posterior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.1.5 Evidence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.2 The position-orientation model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.2.1 Model assumptions and parametrization . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.2.2 Likelihood . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.2.3 Prior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.2.4 Posterior and evidence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.3 The position-orientation model with docking . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.3.1 Model assumptions, parametrization and likelihood . . . . . . . . . 47
vContents
3.3.2 Prior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.3.3 Posterior and evidence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4 The eukaryotic RNA polymerase II 51
4.1 Structure and function . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.2 Questions addressed . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5 Materials and methods 55
5.1 Experimental methods, data acquisition and data pre-processing . . . . . 55
5.1.1 Macromolecular complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.1.2 Isotropic Förster distance measurements . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.1.3 FRET effici