Development of binding and functional assays for the neuropeptide Y Y_1tn2 and Y_1tn4 receptors [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Ralf Ziemek

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• Publié par: universitat_regensburg
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 25
• Langue: Deutsch
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Extrait

Development of binding and
functional assays for the
neuropeptide Y Y and Y receptors2 4


Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV – Chemie und Pharmazie –
der Universität Regensburg












vorgelegt von
Ralf Ziemek
aus Leverkusen
2006
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von April 2002 bis Mai 2006 unter der
Leitung von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer am Institut für Pharmazie der
Naturwissenschaftlichen Fakultät IV – Chemie und Pharmazie – der Universität
Regensburg.

























Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im April 2006


Tag der mündlichen Prüfung: 26. Mai 2006

Prüfungsausschuss:
Prof. Dr. J. Heilmann (Vorsitzender)
Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter)
Prof. Dr. S. Elz (Zweitgutachter)
Prof. Dr. A. Göpferich (Drittprüfer) I












für meine Eltern



















Auf jede Frage eine Antwort wissen nur Dummköpfe
John Steinbeck, amerikanischer Schriftsteller, 1902-1968 II

Danksagungen

An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei:

Herrn Prof. Dr. A. Buschauer für die Gelegenheit, an einem so interessanten Projekt arbeiten zu
dürfen, für seine wissenschaftlichen Anregungen und seine konstruktive Kritik bei der Durchsicht der
Arbeit,

Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt für seine fachliche Anleitung und Vorschläge bei experimentellen
Problemen, sowie für seine kritische Durchsicht der Arbeit,

Frau Prof. Dr. A. Beck-Sickinger (Universität Leipzig) für die Bereitstellung der Peptide sowie des hY -4
eYFP-QC Vektors, korr

Frau Dr. C. Cabrele für die Bereitstellung weiterer Peptidliganden und ihre stete Hilfsbereitschaft,

Herrn Prof. Dr. B. Conklin (University of California) für die Bereitstellung des pcDNA1-qi5-HA Vektors,

Herrn Prof. Dr. S. Thayer (University of Minnesota) für die Bereitstellung des pMTAEQ Vektors,

Herrn Dr. W. Schneider und O. Merkel für die freundliche Unterstützung und Bereitstellung des
pQCXIP und pCL-Eco Vektors sowie der HEK293T Zellen,

Herrn Dr. T. Dobner für die Bereitstellung des pcDNA3.1/Hygro und pcDNA3.1/Zeo Vektors,

Frau Dr. P. Rose (Bristol-Myers Squibb) für die Bereitstellung des pcDNA3-hY Vektors, 2

Frau Prof. Dr. D. Männel für die Bereitstellung des pEGFP-N1 Vektors,

Herrn Dr. J. Langer (University of New Jersey) für die Bereitstellung des pcDEF3 Vektors,

Herrn Prof. Dr. S. Parker (University of Tennessee) für die Bereitstellung der CHO-rY Zellen, 4

Herrn Dr. J. Daniels (Glaxo Wellcome) für die Bereitstellung des Liganden GW1229,

Frau E. Schreiber für die zuverlässige Durchführung der Fura-2 Assays sowie die Unterstützung in der
Betreuung der Zellkulturen,

Herrn A. Brennauer für die Bereitstellung der Y Antagonisten und die entspannte Gesellschaft 2
während des Zusammenschreibens,

Herrn Dr. E. Schneider für die fachliche Unterstützung insbesondere im Umgang mit dem
Durchflußzytometer und für die Montagswitze, die ich allerdings nicht immer verstanden habe,

Frau A. Kraus und Dr. P. Gohrai für die Bereitstellung der H Agonisten, 2

Herrn M. Keller für seine Hilfe mit der HPLC Analytik und Herrn D. Gross für die Hilfe mit der
konfokalen Mikroskopie,

Herrn Dr. J. Klar für die wertvollen Tipps zur Molekularbiologie,

Frau S. Bollwein für ihre Unterstützung auf dem Gebiet der Zellkultur,

Herrn P. Richthammer für seine Hilfsbereitschaft bei technischen Problemen und für seine gute Laune,

Frau S. Heinrich und Frau M. Luginger für Ihre Unterstützung bei organisatorischen Problemen,


III
meinen Kollegen Stephan Braun, Hendrik Preuss, Edith Hofinger, Manuela Menke, Christine Müller,
Peter Jarzyna und Patrick Igel, die mir auch außerhalb der Universität eine schöne Zeit in Regensburg
ermöglichten,

allen Mitgliedern des Lehrstuhls für ihre Kollegialität, Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima,

dem Graduiertenkolleg 760 der DFG für die finanzielle Unterstützung und wissenschaftliche
Förderung,

meiner Freundin Kathrin für ihre Geduld und ihr Verständnis,

und vor allem meinen Eltern und meiner Schwester, auf deren Hilfe und Unterstützung ich mich immer
verlassen konnte.

IV

Poster Presentations




1st Summer School Medicinal Chemistry, Regensburg, September 2002:
R. Ziemek, G. Bernhardt, A. Beck-Sickinger, S. Parker, A. Buschauer
4“A fluorescence labelled analogue of human pancreatic polypeptide, Cy5[Lys ]hPP, for the flow
cytometric determination of NPY Y receptor binding data” 4

Annual Meeting of the GDCh, Fachgruppe Medizinische Chemie, “Frontiers in Medicinal Chemistry”,
Fulda, September 2003:
Ziemek, R., Schneider, E., Mayer, M., Bernhardt, G., Beck-Sickinger, A., Parker, S., Buschauer, A.
“Determination of Activity and Affinity of Neuropeptide Y Receptor Ligands by Flow Cytometry”

7th International NPY Meeting, Coimbra/Portugal, February 2004:
R. Ziemek, G. Bernhardt, C. Cabrele, A. Beck-Sickinger, S. Parker, A. Buschauer
4“A fluorescence labelled analogue of human pancreatic polypeptide, Cy5-[Lys ]hPP, for the flow
cytometric determination of NPY Y receptor binding data” 4

Annual Meeting of the GDCh, Fachgruppe Medizinische Chemie, “Frontiers in Medicinal Chemistry”,
Erlangen, March 2004:
R. Ziemek, G. Bernhardt, C. Cabrele, A. Beck-Sickinger, S. Parker, A. Buschauer
“Flow cytometric determination of binding constants of NPY Y receptor ligands” 4

2nd Summer School Medicinal Chemistry, Regensburg, October 2004:
Ziemek, R., Brennauer, A., Bernhardt, G., Cabrele, C., Beck-Sickinger, A., Buschauer, A.
“Fluorescence-based determination of affinity and activity at the human neuropeptide Y Y receptor 2
using flow cytometry”

Annual Meeting of the German Pharmaceutical Society (DPhG), Regensburg, October 2004:
R. Ziemek, G. Bernhardt, C. Cabrele, A. Beck-Sickinger, A. Buschauer
4“Fluorescent Cy5-[K ]hPP: A tool for the characterization of Neuropeptide Y Y receptor ligands” 4

Meeting of the ChemBioNet, Frankfurt, December 2004:
Ziemek, R., Brennauer, A., Bernhardt, G., Cabrele, C., Beck-Sickinger, A., Buschauer, A.
“Determination of affinity and activity at the human neuropeptide Y Y receptor by flow cytometry and 2
aequorin luminescence”

Annual Meeting of the GDCh, Fachgruppe Medizinische Chemie, “Frontiers in Medicinal Chemistry”,
Leipzig, March 2005:
Ziemek, R., Brennauer, A., Bernhardt, G., Cabrele, C., Beck-Sickinger, A., Buschauer, A.
“Fluorescence- and luminescence-based methods for the pharmacological characterization of
neuropeptide Y Y receptor ligands” 2












V
CONTENTS
1 GENERAL INTRODUCTION ...............................................................................1
1.1 G-protein coupled receptors ................................................................................................... 2
1.2 Receptor models ...................................................................................................................... 4
1.3 Pancreatic polypeptides and their receptors ........................................................................ 7
1.3.1 Distribution and physiological effects of PP-fold peptides ..................................................... 9
1.3.1.1 Pancreatic polypeptide................................................................................................................ 9
1.3.1.2 Peptide YY................................................................................................................................ 10
1.3.1.3 Neuropeptide Y......................................................................................................................... 11
1.3.2 NPY receptors...................................................................................................................... 12
1.3.2.1 The NPY Y receptor................................................................................................................. 14 1
1.3.2.2 The NPY Y recept 17 2
1.3.2.3 T 20 4
1.3.2.4 The NPY Y recept 21 5
1.3.2.5 The NPY yor 24 6
1.3.2.6 The NPY Y recept 24 7
2 SCOPE AND OBJECTIVES ..............................................................................27
3 DEVELOPMENT OF A FLOW CYTOMETRIC BINDING ASSAY FOR THE
HUMAN NPY Y RECEPTOR ..........