Development of recombinant antibody mediated resistance against tomato yellow leaf curl virus [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Mohammad Reza Safarnejad

M.R.Safarnejad

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• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 25
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Development of recombinant antibody-mediated resistance against
Tomato yellow leaf curl virus









Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-
Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen
Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation









vorgelegt von

Master of Science
Mohammad Reza Safarnejad
aus Shiraz, Iran

Berichter: Universitätprofessor Dr. R. Fischer
Privatdozent Dr. C. Peterhänsel








Tag der mündlichen Prüfung: 16.01.2008

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar




Institute for Biology VII (Molecular Biotechnology)
RHEINISCH WESTFÄLISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE AACHEN






PhD Thesis

Development of recombinant antibody-mediated resistance against
Tomato yellow leaf curl virus






Presented by
Master of Science
Mohammad Reza Safarnejad
From Shiraz, Iran








Scientific supervision
Referent: University Professor Dr. R. Fischer
Co-referent: Privatdozent Dr. C. Peterhänsel

Aachen, January 2008









ZUSAMMENFASSUNG
In dieser Studie wird die Expression spezifischer scFv-Fragmente in pflanzlichen Zellen für
die Unterdrückung der Krankheitssymptome durch TYLCV-Infektion genutzt.
Die für Rep, CP und MP kodierenden Gene C1, V1 und V2 wurden mit spezifischen Primern
mit dem kompletten klonierten TYLCV Genom als Template amplifiziert. Die PCR-Produkte
wurden zunächst in den TOPO Vektor und später in die Expressionsvektoren pGEX-5x3-und
pMALc2x kloniert. Die rekombinanten Proteine wurden in E. coli als C-terminale Fusion mit
GST oder MBP exprimiert und durch Affinitätschromatographie aufgereinigt. Darüber hinaus
wurde auch der aminoterminale Teil des CP und des Rep Proteins als Fusionsprotein mit GST
und MBP exprimiert.
Mit Hilfe der Phagen-Display-Technologie wurde ein scFv-Fragment gegen Rep (scFv-
ScRep1) aus der naiven Tomlinson Phagen-Bibliothek isoliert. Darüber hinaus wurde eine
Rep-Phagen-Display-Bibliothek aus Gesamt-RNA der Milz einer präimmunisierten Maus
hergestellt und ein weiteres scFv-Fragment (scFv-ScRep2) identifiziert und charakterisiert.
Die scFv-Fragmente wurden in den bakteriellen pHEN-HI Expressionsvektor kloniert und
mittels Immobilisiertes-Metall-Affinitätschromatographie aufgereinigt. ELISA-und Western-
Blot-Analysen wurden genutzt, um die Bindungsaktivitäten der bakteriell exprimierten scFv
zu analysieren. Die beobachteten hohen Bindungaktivitäten von scFv-ScRep1 sowohl mit
dem Volllängen- als auch dem C-terminalen verkürzten Rep-Protein weisen auf eine
spezifische Bindung hin. ScFv-ScRep2 interagiert dagegen ausschließlich mit dem intakten
Rep-Protein. Vier weitere scFv-Fragmente wurden aus Gesamt-RNA von Hybridomazellen,
welche spezifische MAbs gegen TYLCV-Virionen produzieren, gewonnen.
Der Pflanzenexpressionsvektor pTRAkt wurde zur Klonierung der generierten scFv-
Fragmente einzeln und als amino-terminale Fusion mit GFP verwendet. Darüber hinaus
wurde die nukleare Lokalisationssignalsequenz von Simian Virus 40 für den Kerntransport
der scFv-ScRep1 und scFv-ScRep1-GFP eingesetzt. Alle Konstrukte wurden in einer
transienten Expression durch Agrobakterien-vermittelter Infiltration von Tabakpflanzen
getestet und auf Funktionalität überprüft. Blotting-Analysen zeigten nachweisbare Mengen
von scFv-ScRep1, scFv-ScRep2 und NLS-scFv-ScRep1 in rohem Blattextrakt aus
agroinfiltrierten Pflanzen. Weitere Analysen bewiesen auch die Bindungsfähigkeit der aus den
Blättern extrahierten scFvs gegen rekombinantes Rep-Protein. Die Ergebnisse der
Fluoreszenz-Mikroskopie bestätigten die Lokalisierung von scFv-ScRep1-GFP-, scFv-
ScRep2 GFP- und scFv-NLS-ScRep1-GFP-Fusionprotein im Zellkern bzw. dem Zytoplasma.


Ausgesuchte Konstrukte wurden für die stabile Transformation von N. benthamiana Pflanzen
durch die Blattscheibenmethode verwendet. Nachfolgende Resistenzuntersuchungen wurden
mit einem infektiösen Volllängenklon (pBIN19-2TYLCV Ir) und Agrobakterien-vermittelter
Infektion im 5-8 Blattstadium durchgeführt. Frühe Symptome wie Blattrollen und
Wachstumsreduktion der Blätter wurden auf nicht transgenen und sensitiven transgenen
Pflanzen 3-4 Wochen nach der Inokulation beobachtet. Die Akkumulation der viralen DNA-
und die Anwesenheit des Virushüllproteins in den Pflanzen wurden durch PCR-Analyse,
Southern Blotting und TAS-ELISA-Test nachgewiesen. Die Ergebnisse der PCR-Analyse
bestätigten die Anwendbarkeit dieser Technik für die Erkennung von Virus-DNA im rohen
Blattextrakt von inokulierten Tabakpflanzen. Die TAS-ELISA-Ergebnisse zeigen, dass dieser
Test nur nützlich für die Erkennung von infizierten Pflanzen mit schweren Symptomen und
gleichzeitiger hoher Viruskonzentration ist. Man ist mit diesem ELISA nicht in der Lage
zwischen gesunden Pflanzen und denen mit milden Symptomen und niedrigem Virustiter zu
unterscheiden.
Zusätzliche Hybridisierungsanalysen wurden für die Erkennung der verschiedenen
replikativen viralen DNA-Konformationen wie z.B. offener Kreis, linearisiert und supercoiled
dsDNA sowie ssDNA herangezogen. Southern-Blotanalysen bestätigten die Reduktion bzw.
vollständige Unterdrückung der viralen DNA-Replikation in symptomlosen Pflanzen. Die
Bewertung des Resistenzgrads bei den T0 Pflanzen wurde 5 Wochen nach der Inokulation
durchgeführt. Resistenztests mit den T0 Nachkommen zeigten, dass alle NSR-, HSC2-,
HSC3- und HSC4-Linien sowie Wildtyp-Pflanzen anfällig für TYLCV sind. Die SRG-, SR-
und RW-Linien zeigten ein unterschiedliches Ausmaß der Resistenz im Bereich von 8-28
Prozent.
Unabhängige T1-transgene Pflanzen wurden zur Resistenztestung im 5-8 Blattstadium
agroinfiziert. Inokulierte Pflanzen wurden bezüglich der Entwicklung von
Krankheitssymptomen als auch mit Hilfe von DNA-Hybridisierung analysiert. Frühe
Symptome erschienen bei nicht transgenen und sensitiven Pflanzen bereits 2-3 wpi und
entwickelten sich in den darauf folgenden Wochen weiter, Resistenzausprägung wurde bei 4-
5 wpi beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass alle T1 Nachkommen der RW14, RW22 und
SR27 Pflanzen typische TYLCV-Symptome ausbilden, während bei SRG T1-Pflanzen, die
das ScRep1-GFP rekombinante Fusionsprotein exprimieren, ein Spektrum von Symptomen
von schweren zu milden und auch das vollständige Fehlen jeglicher Symptome zu beobachten
war. Der Resistenzphänotyp zeichnet sich durch Abwesenheit oder eindeutige Verringerung
der Krankheitssymptome und eine gleichzeitige deutliche Reduktion bzw. vollständige

Unterdrückung der viralen DNA-Replikation aus. Die T1 Pflanzen aus den SRG28 und
SRG18 Linien zeigten die höchsten Resistenzwerte. Vergleichende Q-PCR- und GFP-
Fluoreszenz-Intensitätsanalysen wiesen darauf hin, dass Pflanzen mit höheren
Transkriptkonzentrationen auch ein höheres Maß an Virusresistenz besitzen.
Durch die hohe Ähnlichkeit der Rep-Proteine unter den Begomoviren, ist eine breitere
Resistenzausprägung auch gegenüber verwandten Viren, wie z.B. ACMV möglich. Aufgrund
der hohen Empfindlichkeit von N. benthamiana gegen TYLCV und dem hohen
Inokulumsdruck bei der Agroinfektion von Pflanzen kann die schützende Fähigkeit der
rekombinanten scFvs eventuell leichter überwunden werden. Daher sollten die
Infektiösitätsassays als Kontrolle mit entsprechenden transgenen Tomatenpflanzen und mit
Hilfe des natürlichen Übertragungsvektors B. tabaci überprüft werden. Da die viralen
Hüllproteine von entscheidender Bedeutung für die Übertragung durch Insekten sind, ist die
Expression der in dieser Arbeit beschriebenen Viruspartikel-spezifischen scFvs in transgenen
Tomatenpflanzen besonders vielversprechend.
















Summary
In this study, we exploited the expression of specific scFv fragment in plant cells for
suppression of disease symptoms caused by TYLCV infection.
The C1, V1 and V2 genes encoding Rep, CP and MP, respectively, were amplified with
specific primers using the full length TYLCV genome construct pBIN19-2TYLCV-Ir as
template. The PCR products were first cloned into the TOPO vector and subsequently into
pGEX-5x3 and pMALc2x expression vectors. Recombinant proteins were expressed in E. coli
as C-terminal fusion with GST or MBP and purified proteins obtained by affinity
chromatography method. In addition, the amino terminal part of CP and Rep proteins were
also cloned and expressed as fusion proteins with GST and