Distance measurements between paramagnetic centers by high-field EPR relaxation experiments [Elektronische Ressource] / von Marloes Penning de Vries

Ak Prisner

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• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2007
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Distance Measurements between
Paramagnetic Centers by High-Field EPR
Relaxation Experiments











Dissertation
zur Erlangerung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften



vorgelegt beim Fachbereich
Chemische und Pharmazeutische Wissenschaften
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main


von
Marloes Penning de Vries
aus Wageningen, die Niederlande


Frankfurt am Main 2007
D30




























vom Fachbereich
Chemische und Pharmazeutische Wissenschaften der
Johann Wolfgang Goethe-Universität
als Dissertation angenommen.



Dekan: Prof. Dr. H. Schwalbe

1. Gutachter: Prof. Dr. T.F. Prisner
2. Gutachter: Prof. Dr. H. Schwalbe

Datum der Disputation:















To my family

Especially to my big brother,
who missed out on the best part

Kurzfassung


In dieser Dissertation wird von Untersuchungen der dipolaren Kopplung mit Hilfe
von G-Band (180 GHz, 6.4 T) Elektron Paramagnetischen Resonanz (EPR)
Relaxationsmessungen berichtet. Die Doktorarbeit besteht aus drei Teilen.
Das Ziel des ersten Teils war die Ermittlung der Geometrie des Protein-Protein
Komplexes, das von den zwei Elektronentransferpartnern Cytochrom c und Cytochrom c
Oxidase (CcO) gebildet wird. Dazu wurden Mischungen von CcO mit drei verschiedenen
Cytochromen für die EPR Messungen verwendet.
In dem zweiten Teil wurde das Simulationsprogramm, das zur Interpretation der
dipolaren Relaxationsergebnissen angewendet wurde, getestet, in dem Messungen an
Modellsystemen durchgeführt wurden. Diese Modellsysteme sind lineare Moleküle mit
2+ 2+jeweils einem Nitroxidradikal und einem paramagnetischen Metallion (Cu , Mn ).
Zuletzt werden T Messungen an paramagnetischen Metallionen, ebenfalls im 1
Hochfeld, präsentiert. Diese wurden durchgeführt um zu zeigen, dass die T Relaxation 1
der untersuchten Metallionen bei tiefer Temperatur stark vom Magnetfeld abhängig ist.


K.1. Theorie

Das Messen von Abständen zwischen ungepaarten Elektronen ist ein Thema in der
EPR das in den letzten Jahren wesentlich an Bedeutung gewonnen hat. Die am meisten
angewandte Methode ist DEER, auch PELDOR genannt, was eine englische Abkürzung für
„gepulste Elektron-Elektron Doppel Resonanz“ ist. Diese Methode wird angewandt zu der
Bestimmung des Abstands zwischen zwei, oder mehreren, paramagnetischen Zentren, oft
organischen (Nitroxid-) Radikalen. Eine wichtige Voraussetzung für das PELDOR
Experiment ist, daß die Spektren der beteiligten Elektronenspins nicht zu breit sind, da
genügend Spins angeregt werden müssen damit ein PELDOR Effekt sichtbar ist.
Für paramagnetische Zentren mit großer g-Anisotropie, wie z.B. low-spin
Eisen(III), ist allerdings die dipolare Relaxationsmessung eine bessere Methode zur
Abstandsbestimmung. Diese Methode beruht auf dem Prinzip daß die schnelle T 1
Relaxation eines Spins (B) dazu führen kann, dass die T Relaxationsrate eines 2
gekoppelten Spins (A) erhöht wird. Die Stärke dieses Effekts hängt von den folgenden
Strukturparametern ab: dem Abstand r zwischen den gekoppelten Spins; den Winkeln θ D
und φ die der Vektor zwischen den Spins in bezug auf den g-Tensor des A Spins bildet; D
den Euler Winkeln α, β und γ, die die relative Orientierung der Spins A und B
dipkennzeichnen (Abbildung K.1). Außerdem ist die dipolare Relaxationsrate 1/T 2
abhängig von der Relaxation des B Spins, T . Da T stark temperaturabhängig ist, ist die 1f 1f
dipolare Relaxation somit auch von der Temperatur abhängig.


Abbildung K.1. Parameter, die wichtig für die Berechnung der dipolaren
Kopplung sind. Die z-Achse des Spins A ist parallel zu dem Magnetfeld
angeordnet. A und B, resonanter bzw. nicht-resonanter gekoppelter Spin;
r, Abstand zwischen den beiden paramagnetischen Zentren; θ und φ D D
sind die dipolaren Winkel.
- VI - dipDie Temperaturabhängigkeit der dipolaren Relaxationszeit ist sehr charakteristisch: T 2
nimmt zunächst mit der Temperatur ab, bis die T Relaxationsrate des B Spins gleich 1
-1groß ist wie die dipolare Kopplung (in rad s ). Eine weitere Abnahme des T (durch 1f
dipZunahme der Temperatur) führt zu einer Zunahme der T . Die Temperaturabhängigkeit 2
ist in Abbildung K.2 dargestellt.
Näherungen für die dipolare Relaxationszeit in den Grenzfällen sind wie folgt:
2 dipFür niedrige Temperatur (R << 1) :T = T2 1f
2 dip 2Für hohe Temperatur (R >> 1): T = 1/2 ∆ T2 1f
2 -2 2 -1mit R = T - ∆ und ∆ als die Hälfte der dipolaren Kopplung in rads . 1f

6Abbildung K.2. Dipolare 1x10
dip) des Spins Relaxationsraten (1/T2
5
8x10A, der mit einer dipolaren Kopplung
-1 (6.2 MHz) mit von ∆ = 39 rads
56x10einem Spin B gekoppelt ist. Bei
niedriger Temperatur, wo
54x10dip >> ∆, ist T = T ; ein 1/T1f 2 1f
Maximum der dipolaren 5
2x10
Relaxationsrate befindet sich bei
= ∆; bei hoher Temperatur, 1/T1 f 0
4 5 6 7 8 9
dip 2 10 10 10 10 10 10<< ∆, gilt: T = 2/ ∆ T . wo 1/T1f 2 1f -1
1/T (s )
1f
Bei niedriger Temperatur ist die dipolare Relaxation also unabhängig von dem
genauen Wert der dipolaren Kopplung ∆. Die dipolare Relaxation ist dann isotrop und das
Signal zerfällt mono-exponentiell mit einer Zeitkonstante gleich T . Bei hoher 1f
Temperatur hängt die dipolare Relaxation sehr stark von der dipolaren Kopplung ab und
sie ist anisotrop. Das heisst, dass verschiedene Positionen im EPR Spektrum mit
dipunterschiedlichen T Zeiten relaxieren, da Spins die unterschiedlich angeordnet sind 2
wegen der Winkelabhängigkeit des ∆ unterschiedlich starke dipolare Kopplung erfahren.
An einer Position im Spektrum wo viele Spins mit unterschiedlichen Orientierungen zu
dem Signal beitragen, ist die dipolare Relaxation nicht exponentiell, weil sie aus der
Summe von vielen dipolaren Relaxationskurven entsteht. Wenn man diese
unterschiedlichen Beiträge spektral trennen könnte, könnte man die Orientierung der
zwei Spins zu einander, und die des dipolaren Vektors zu dem g-Tensor des A Spins
bestimmen.
Eine bessere Auflösung des EPR Spektrums bekommt man, wenn man bei höheren
Mikrowellenfrequenzen, und somit bei höheren Magnetfeldern misst. Die EPR Spektren
vieler paramagnetischen Zentren können erst von Spektrometern aufgelöst werden, die
eine Frequenz von mindestens 90 GHz haben. Eine gute Auflösung eines Spektrums ist
die Voraussetzung für die Bestimmung der Orientierung zweier gekoppelter Spins.

- VII -
dip -1
Dipolare Relaxationsrate 1/T (s )
2
K.2. Cytochrom c und Cytochrom c Oxidase

Die Elektronentransportkette, oder Atmungskette, besteht aus fünf Proteinen:
Komplex I bis Komplex V. Die Atmungskette ist der letzte Schritt des Glukose-Abbaus,
und hat die Funktion einen Protonengradienten über die Membran zu bilden. Komplex IV
der Atmungskette, die CcO, ist ein Protein, das die Oxidation von Cytochrom c katalysiert
und die Elektronen für die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser verwendet. Dabei
transportiert die CcO Protonen durch die Membran, von der inneren zur äusseren
Membranseite, und baut damit einen elektrochemischen Gradienten auf. Dieser Gradient
wird von Komplex V, der ATP Synthase, für die Bildung von ATP aus ADP und Phosphat
benutzt.
Cytochrom c ist ein kleines Protein dessen Funktion der Elektronentransfer ist. In
der Atmungskette pendelt es zwischen den Komplexen III und IV, mit denen es jeweils
einen kurzlebigen Komplex bildet, damit es zu Elektronenübertragungen kommen kann.
Die Proteine der mitochondrialen Atmungskette bestehen aus vielen Subunits und
sind daher sehr groß und komplex. Die Atmungskette in aeroben Bakterien ist sehr
ähnlich, allerdings sind hier die Proteine fast nur auf die für die primäre Funktion
wichtigen Bestandteile beschränkt. Deshalb werden viele Studien mit bakteriellen
Proteinen durchgeführt. Für diese Arbeit wurden Proteine des Bakteriums Paracoccus
denitrificans (P.d.) gemessen.

Obwohl die 3D Strukturen der Proteine CcO und Cytochrom c des P.d. bekannt 552
sind [Iwata et al. 1995; Reincke et al. 2001], gibt es noch viele offene Fragen, die nicht
mit den bekannten Strukturen beantwortet werden können. Eine davon ist, wie der
Protein-Proteinkomplex aussieht, der von Cytochrom c und CcO gebildet wird, bevor es
zur Elektronenübertragung kommt. Da beide Proteine in ihrer oxidierten Form
3+paramagnetische Zentren haben (u.a. Cu in CcO und Fe in Cytochrom c), ist EPR eine A
geeignete Methode diese Frage zu beantworten.

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