Endocytosis controlled by monolayer area asymmetry [Elektronische Ressource] / Nina Ohlwein. Gutachter: Sophie Cribier ; Thomas Günther-Pomorski ; Andreas Herrmann

Diplom-Biophysikerin Nina Ohlwein

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• Publié le: 01 janvier 2011
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Extrait

Endocytosis Controlled by Monolayer Area Asymmetry
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biophysik
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin
von
Diplom-Biophysikerin Nina Ohlwein
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Professor Dr. Jan-Hendrik Olbertz
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Professor Dr. Andreas Herrmann
Gutachter:
1. Professor Dr. Sophie Cribier
2.r Dr. Thomas Günther-Pomorski
3. Professor Dr. Andreas Herrmann
eingereicht am: 10. Mai 2011
Tag der mündlichen Prüfung: 5. Oktober 2011„...Geheimnisvoll am lichten Tag
Lässt sich Natur des Schleiers nicht berauben,
Und was sie deinem Geist nicht offenbaren mag,
Das zwingst du ihr nicht ab mit Hebeln und mit Schrauben. ...“
Johann Wolfgang von GoetheAbstract
Endocytic engulfment requires high local membrane curvature and causes signif-
icant area changes of the membrane leaflets with respect to each other. Beside
individual proteins this can be initiated by differences between the surface areas
of the two monolayers related to leaflet specific modulation of lipid composition.
Thus, it was proposed that ATP-dependent lipid translocators, pumping phospho-
lipids from one membrane leaflet to the opposite leaflet, account for generation of
altered area relation between both leaflets as an early step in endocytosis.
To elucidate the influence of differences in the monolayer area asymmetry of the
plasma membrane on endocytosis, surface area relation was altered by adding exoge-
nous phospholipids to living cells and changes in endocytic activity were distinctly
quantified. Depending on the lipid species, exogenous lipids were only incorpo-
rated into the outer layer or subsequently translocated across the plasma membrane
thereby increasing either the outer or inner surface area.
Addition of different analogues of aminophospholipids, which are translocated to
the inner leaflet, led to an enhancement of bulk flow endocytosis in K562 cells.
Moreover, our data indicate that clathrin-mediated endocytosis of Hep2 cells was
stimulated as well. Inversely, addition of analogues of phosphatidylcholine, which
are not recognised by lipid translocators, reduced bulk flow or clathrin-mediated
endocytosis in various cell lines. Notably, also clathrin-mediated endocytosis was
influenced by the addition of lipids, although many proteins noted for their ability
to induce membrane curvature are known to be implicated in this pathway.
This corroborates a recent model how aminophospholipid translocases are impli-
cated in endocytosis. Upon translocating lipids from the exo- to the cytoplasmic
leaflet and additionally interacting with endocytic accessory proteins, aminophos-
pholipidtranslocasescouldintegratetwoprocessestogeneratecurvature: membrane
bendingbasedonareaasymmetryofmembranemonolayersandprotein-basedmech-
anisms to induce and stabilise curvature. Collectively, findings in the present study
and in recent publications suggest that monolayer area asymmetry induced by the
translocation of lipids is not the only but one of the mechanisms leading to curvature
generation necessary for endocytic events.
vZusammenfassung
EndozytotischeEinstülpungenerforderneinehohelokaleMembrankrümmungund
führen zu erheblichen Flächenänderungen der Membranhälften, die gegenseitig von-
einander abhängen. Neben bestimmten Proteinen kann dies durch eine Oberflächen-
differenz zwischen den Schichten initiiert werden, die durch die spezifische Anpas-
sung der Lipidzusammensetzung einer Membranhälfte hervorgerufen werden kann.
Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass ATP-abhängige Lipid-Transporter, die
Phospholipide von der einen auf die gegenüberliegende Membranseite pumpen, in
der Anfangsphase der Endozytose für veränderte Flächenverhältnisse zwischen den
Membranschichten verantwortlich sind.
Um den Einfluss veränderter Flächenasymmetrien der Plasmamembranschichten
auf Endozytose zu untersuchen, wurden in lebenden Zellen die Oberflächenverhält-
nisse der Membranhälften durch die Zugabe von exogenen Phospholipiden verän-
dert und Unterschiede der endozytotischen Aktivität bestimmt. Abhängig von der
Sorte wurden die exogenen Lipide nur in die äußere Membranschicht eingebaut
oder anschließend auch auf die innere Membranseite transportiert, wodurch entwe-
der die äußere oder innere Oberfläche vergrößert wurde. Die Zugabe verschiedener
Aminophospholipid-Analoga, die auf die innere Membranseite transportiert werden,
führte zu gesteigerter bulk flow-Endocytose in K562-Zellen. Darüber hinaus deuten
die Ergebnisse darauf hin, dass Clathrin-vermittelte Endozytose von Hep2-Zellen
ebenfalls stimuliert wurde. Umgekehrt hatte die Zugabe von Phosphatidylcholin-
Analoga, die nicht von Lipid-Transportern erkannt werden, reduzierte bulk flow-
oder Clathrin-vermittelte Endozytose in verschiedenen Zelllinien zur Folge. Bemer-
kenswert ist, dass auch Clathrin-vermittelte Endozytose durch die Lipidzugabe be-
einflusst wurde, obwohl gerade in diesem Endozytoseweg viele Proteine involviert
sind, die Membrankrümmungen induzieren können.
Dies passt zu einem neuen Modell wie Aminophospholipid-Transporter in Endo-
zytose involviert sind. Durch den Lipidtransport von der exo- auf die zytoplasma-
tische Membranhälfte und die zusätzliche Interaktion mit endozytotischen Hilfspro-
teinen, könnten diese Transporter zwei Mechanismen zur Erzeugung von Krümmung
miteinander verbinden: Membrankrümmung induziert durch eine Flächenasymme-
trie zwischen den Membranhälften und durch Wechselwirkung mit Proteinen, die
Krümmung sowohl generieren als auch stabilisieren können. Zusammen genommen
deuten die Ergebnisse dieser Arbeit so wie neuere Veröffentlichungen darauf hin,
dass die durch Lipidtransport induzierte Flächenasymmetrie der Membranschichten
nicht der einzige aber einer der Mechanismen ist, der die für Endozytose notwendige
Membrankrümmung erzeugt.
viiContents
Abbreviations xi
1 Introduction 1
1.1 Plasma Membrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1 Lipid Composition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.2 Lateral Heterogenous Organisation of Lipids . . . . . . . . . . . . . 6
1.1.3 Transbilayer Lipid Asymmetry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.1.4 Lipid Translocators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2 Endocytosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.1 Clathrin-Mediated Endocytosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.2.2 Clathrin-Independent Endocytosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.3 Bending a Membrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.3.1 Shape Changes of GUV Induced by Lipid Asymmetry . . . . . . . 27
1.3.2 How Endocytosis is Linked to Lipid Asymmetry . . . . . . . . . . 29
2 Aim 35
3 Material and Methods 37
3.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.1.1 Chemical Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.1.2 Cell Lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.2 Spectrofluorometry of Bulk Flow Endocytosis . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.2.1 Preparation of Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.2.2 Incubation with Exogenous Lipids . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.2.3 Biotinylation and FITC Labelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.2.4 Spectrofluorometric Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.2.5 Quantification of Endocytic Activity . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.3 Spectrofluorometry of Clathrin-Endocytosis . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.3.1 Preparation of Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.3.2 FITC Labelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
ixContents
3.4 Flow Cytometry for Receptor-Endocytosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.4.1 Preparation of Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4.2 Incubation with Antibodies and Exogenous Lipids . . . . . . . . . 44
3.4.3 Analysis and Quantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.5 Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.5.1 Preparation and Labelling of Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.5.2 Fluorescence Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4 Results 49
4.1 Improvement of the Spectrofluorometric Assay . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.1.1 Loss of Fitness . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.1.2 Influence of Label Concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
4.1.3 Change of Lipid Incubation and Temperature . . . . . . . . . . . . 57
4.2 Influence of Exogenous Lipids on Endocytosis . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.2.1 Bulk Flow Endocytosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.2.2 Clathrin-Independent Bulk Flow Endocytosis . . . . . . . . .