Engineered human cytochrome c: investigation of superoxide and protein-protein interaction and application in bioelectronic systems [Elektronische Ressource] / von Franziska Wegerich

Franziska Wegerich

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: universitat_potsdam
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 65
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 7 Mo

Extrait

 
  
Universität Potsdam 
Institut für Biochemie und Biologie 
 
 
 
Engineered human cytochrome c: Investigation of superoxide and 
protein­protein interaction and application in bioelectronic systems 
 
 
 
 
Dissertation 
zur Erlangung des akademischen Grades 
"doctor rerum naturalium" 
(Dr. rer. nat.) 
in der Wissenschaftsdisziplin "Biochemie" 
 
 
eingereicht an der 
Mathematisch­Naturwissenschaftlichen Fakultät 
der Universität Potsdam 
 
 
 
von 
Franziska Wegerich 
 
 
 
 
Potsdam, den 15. September 2010  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Published online at the 
Institutional Repository of the University of Potsdam: 
URL http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2011/5078/ 
URN urn:nbn:de:kobv:517‐opus‐50782 
http://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:517-opus-50782 Dissertation – Franziska Wegerich 
LIST OF ABBREVIATIONS   
   
ET  electron transfer 
proton coupled electron transfer PECT 
Self‐assembled monolayer SAM 
  
 Proteins 
  
cyt c  Cytochrome c 
XOD  Xanthine oxidase 
BOD  Bilirubin oxidase 
SOX  Sulfite oxidase 
SOD  Superoxide dismutase 
Molybdenum cofactor Moco 
wild‐type WT 
  
 Chemicals 
  
MUA  11‐Mercaptoundecanoic acid 
MU  11‐Mercaptoundecanol 
MPA  Mercaptopropionic acid 
PASA  Poly(anilinesulfonic acid) 
HX  Hypoxanthine 
Dithiothreitol DTT 
IPTG  β‐D‐1‐thiogalactopyranoside 
EDC  N‐Ethyl‐N‐(3‐
  dimethylaminopropyl)carbodiimide 
  hydrochloride 
   
Methods   
   
CV  Cyclic voltammetry 
AFM  Atomic force microscopy 
SPR  Surface plasmon resonance spectroscopy 
LbL  Layer‐by‐Layer 
LB  Langmuir‐Blodgett 
NMR  nuclear magnetic resonance spectroscopy 
1 1H NMR  one dimensional  H NMR… 
1 15 1 15H‐ N HSQC NMR  two‐dimensional  H‐ N  heteronuclear  single 
  quantum coherence NMR 
Units   
   
Da  Dalton 
M  Molar 
A  Ampere 
V  Volt 
‐3k  kilo‐ (10 ) 
‐3m  mili‐ (10 ) 
‐6μ  micro‐ (10 ) 
‐9n  nano‐ (10 ) 
‐12p  pico‐ (10 ) 
   
   
 
III  
 
 
 
 
 
 
 Dissertation – Franziska Wegerich 
TABLE OF CONTENTS 
1  INTRODUCTION ................................................................................................................................... 1 
1.1  General motivations for this work .......................................................................................... 1 
1.2  Aim of this work .............................................................. 3 
 
2  LITERATURE SURVEY .......................................................................................................................... 4 
2.1  Redox proteins and enzymes .................................................................................................... 4 
2.1.1  Cytochrome c ........................................................ 4 
2.1.1.1  The role of cytochrome c in nature ............................................................. 5 
2.1.1.2  The reaction of cytochrome c with superoxide ...................................... 9 
2.1.1.3  Comparison of human and horse cytochrome c structure ............. 11 
2.1.1.4  Examples of mutational studies with cytochrome c.......................... 12 
2.1.2  Superoxide dismutase .................................................................................................. 13 
2.1.3  Bilirubin oxidase ............................................................................................................. 15 
2.1.4  Sulfite oxidase ................................................... 16 
2.2  Biosensors ....................................................................... 19 
2.2.1  Electrochemical biosensors based on direct protein electrochemistry ... 19 
2.2.2  Examples of protein engineering for biosensor applications....................... 21 
2.2.3  Layer‐by‐Layer technique for biosensor applications .................................... 22 
2.3  Superoxide radicals .................................................................................................................... 24 
2.3.1  Role of superoxide radicals in nature ..................................................................... 24 
2.3.2  Detection methods for superoxide ..............................26 
 
3  MATERIALS AND METHODS ............................................................................................................ 29 
3.1  Materials ......................................................................................................................................... 29 
3.1.1  Materials ......... 29 
3.1.2  Buffers .................................................................. 29 
3.2  Methods .................... 30 
3.2.1  Preparation of cytochrome c mutants ................................................................... 30 
3.2.1.1  Mutation of human cytochrome c ............................................................. 30 
3.2.1.2  Recombinant expression and purification of wild‐type and 
mutated human cytochrome c .................................................................... 30 
3.2.2  NMR measurements ...................................................................................................... 31 
3.2.3  Spectrophotometric measurements ....................................................................... 32 
3.2.3.1  Reaction with superoxide ............................................................................. 32 
3.2.4  SPR measurements .......................................................... 33 
3.2.5  Electrochemical measurements ............................................................................... 33 
3.2.5.1  Measurements with cytochrome c in solution..................................... 34 
3.2.5.2  Measurements with adsorbed cytochrome c .......................34 
V Table of Contents 
3.2.5.3  Construction and usage of the superoxide sensor electrodes ....... 35 
3.2.5.4  Reaction of cytochrome c with sulfite oxidase and bilirubin 
oxidase in solution ........................................................................................... 35 
3.2.5.5  Construction of the cyt c / BOD multilayer electrodes .........