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Etude des propriétés angiogéniques du système Wnt/Frizzled : implication du récepteur Frizzled 4 dans la morphogénèse artérielle, Study of Wnt/Frizzled angiogenic properties : implication of Frizzled 4 receptor in arterial morphogenesis

De
300 pages
Sous la direction de Cécile Duplaa
Thèse soutenue le 15 décembre 2009: Bordeaux 2
De plus en plus d’études impliquent la signalisation Wnt/Frizzled (Wnt/Fzd) dans la formation des vaisseaux. La première partie de ce manuscrit démontre d’ailleurs que la signalisation Wnt, via son régulateur sFRP1 et un de ses ligands, Wnt4, potentialise les effets angiogéniques des cellules souches mésenchymateuses lors de l’angiogénèse. Le récepteur Frizzled4 (Fzd4), lui, est impliqué dans le développement vasculaire de la rétine puisque la délétion du gène fzd4 révèle une malformation du réseau vasculaire rétinien secondaire et tertiaire. Le but de ce travail a été d’étudier l’implication de Fzd4 dans la régulation de la morphogenèse vasculaire chez l’adulte. Il s’avère que Fzd4 présente un profil d’expression plutôt artériel, et que la délétion de ce gène empêche la formation d’un réseau artériel normal des organes périphériques. Des études in vitro réalisées sur des cellules vasculaires primaires ont mis en évidence plusieurs altérations de leurs propriétés angiogéniques. Cette étude a donc démontré un rôle central de Fzd4 dans la croissance vasculaire. Fzd4 régule les propriétés des cellules vasculaires mises en jeu dans l’angiogenèse, et régule la morphogenèse des ramifications vasculaires in vivo. Pour identifier et comprendre les mécanismes moléculaires induits par le récepteur Fzd4, une étude sur la protéine centrale du système Wnt/Fzd, l’isoforme Dishevelled (Dvl), et sur ses partenaires intracellulaires, a été initiée. Les premiers résultats suggèrent que les isoformes 1 et 3 de Dvl participent via Fzd4 à l’activation de la voie canonique nécessaire à la prolifération cellulaire. De plus, certains partenaires intracellulaires de Dvl3 ont pu être sélectionnés par une méthode de double hybride réalisée chez la levure.
-Frizzled4
-Réseau artériel
-Ramifications vasculaires
-Cellules vasculaires
-Propriétés angiogéniques
Growing evidences link Wnt/Frizzled (Wnt/Fzd) pathway to proper vascular formation. The first part of this manuscript shows besides that Wnt pathway, via its regulator sFRP1 and one of its ligands, Wnt4, potentiates mesenchymal stem cells angiogenic properties during angiogenesis. An other Frizzled receptor (Fzd), Fzd4, has been shown to be implicated in retinal vascular formation because inactivation of the fzd4 gene revealed a malformation of the secondary and tertiary retinal vascular network. Here, we investigated the involvement of Fzd4 in adult vascular morphogenesis regulation. Fzd4 present an arterial vascular pattern, and the deletion of fzd4 impairs a normal arterial network formation in peripheral organs. In vitro studies on primary vascular cells show several alterations on their angiogenic properties. This study reveals a central role of Fzd4 in vascular growth. Fzd4 regulate angiogenic vascular cell properties and vascular branching morphogenesis in vivo. To further understand molecular mechanisms induced by Fzd4, we started to study the Wnt/Fzd central protein, Dishevelled (Dvl), and its intracellular partners. First results suggest that Dvl 1 and 3 isoforms would participate with Fzd4 to activate Wnt canonical pathway implicated in cell proliferation. Moreover, some Dvl3 partners could be selected by a yeast two-hybrid method.
-Frizzled4
-Arterial network
-Vascular branching
-Vascular cells
-Angiogenic properties
Source: http://www.theses.fr/2009BOR21670/document
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Université Victor Segalen Bordeaux 2
Année 2009 Thèse n°1670
THESE
Pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE BORDEAUX 2
Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Biologie-Santé
Présentée et soutenue publiquement
Le 15 décembre 2009
Par Betty DESCAMPS
Née le 22 Janvier 1983 à Roncq
ETUDE DES PROPRIETES ANGIOGENIQUES DU SYSTEME
WNT/FRIZZLED
-------------------!
IMPLICATION DU RECEPTEUR FRIZZLED 4 DANS LA
MORPHOGENESE ARTERIELLE
Membres du Jury
Mr Andreas BIKFALVI Directeur de recherche Président
Mr Hervé PRATS Directeur de recherche Rapporteur
Mr Daniel HENRION Directeur de recherche Rapporteur
Mme Mireille MONTCOUQUIOL Chargée de recherche Membre
Mr Frédéric JAISSER Directeur de recherche Membre
Mme Cécile DUPLAA Directeur de recherche Directeur de thèse

























Université Victor Segalen Bordeaux 2
Année 2009 Thèse n°1670
THESE
Pour le
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE BORDEAUX 2
Mention : Sciences Biologiques et Médicales
Option : Biologie-Santé
Présentée et soutenue publiquement
Le 15 décembre 2009
Par Betty DESCAMPS
Née le 22 Janvier 1983 à Roncq
ETUDE DES PROPRIETES ANGIOGENIQUES DU SYSTEME
WNT/FRIZZLED
-------------------
IMPLICATION DU RECEPTEUR FRIZZLED 4 DANS LA
MORPHOGENESE ARTERIELLE
Membres du Jury
Mr Andreas BIKFALVI Directeur de recherche Président
Mr Hervé PRATS Directeur de recherche Rapporteur
Mr Daniel HENRION Directeur de recherche Rapporteur
Mme Mireille MONTCOUQUIOL Chargée de recherche Membre
Mr Frédéric JAISSER Directeur de recherche Membre
Mme Cécile DUPLAA Directeur de recherche Directeur de thèse
1A tous les membres du jury,
Je vous remercie d’avoir accepté de juger ce travail
2TABLEDESMATIERES
3TABLE DES MATIERES ......................................................................................................... 3
ABBREVIATIONS.................................................................................................................... 9
AVANT PROPOS.................................................................................................................... 13
INTRODUCTION 16
Chapitre I : Le système Wnt/Frizzled ..................................................................................... 17
I. Wnt, Frizzled et Dishevelled............................................................................................ 17
A. Mise en place................................................................................................................ 17
B. Les ligands Wnt............................................................................................................ 19
1. Gènes........................................................................................................................ 19
2. Structure des protéines ............................................................................................. 24
3. Fonctions .................................................................................................................. 24
C. Les récepteurs Frizzled................................................................................................. 25
1. Gènes 25
2. Structure des protéines 29
3. Localisation .............................................................................................................. 30
4. Mécanisme d’activation ........................................................................................... 30
D. Lipoprotein Receptor-related Proteins 5/6 (LRP5/6) ................................................... 31
E. Dishevelled: Plaque tournante du système Wnt/Fzd.................................................... 32
1. Structure de Dishevelled .......................................................................................... 32
2. Localisation de Dishevelled ..................................................................................... 34
3. Implication de Dvl dans les voies de signalisation .................................................. 35
II. La voie canonique Wnt/Fzd ............................................................................................. 36
A. !"#$%&'(")"#*"#*+,-.*./0%1#23452)01"56789:#;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;#9<
1. Adenomatous Polyposis Coli (APC)........................................................................ 38
2. Axine ........................................................................................................................ 38
3. Glycogen Synthase Kinase 3! (GSK3!).................................................................. 39
B. La protéine centrale de la voie canonique : la !-caténine ............................................ 41
1. Structure et localisation............................................................................................ 41
2. Régulation dans la voie Wnt canonique................................................................... 41
3. Régulation transcriptionnelle : rôle des facteurs LEF/TCF ..................................... 42
III. Les voies dites non canoniques Wnt/Frizzled .............................................................. 43
A. La voie de polarité planaire cellulaire (PCP) ............................................................... 44
1. L’activation des petites GTPases Rho et Rac dans la voie PCP .............................. 45
2. Mécanismes d’activation de Dvl dans la voie PCP.................................................. 46
a) Les multiples éléments de la voie PCP ................................................................ 46
b) Mécanismes moléculaires et cellulaires de la voie PCP ...................................... 48
c) Localisation subcellulaire des éléments de la voie PCP 48
2+B. La voie non canonique Wnt/Ca ................................................................................. 50
IV. Modulateurs extracellulaires ........................................................................................ 51
A. Antagonistes de Wnt .................................................................................................... 52
41. Secreted Frizzled Related Proteins (sFRP) .............................................................. 52
a) Structure et fonction des sFRP ............................................................................. 52
b) Mécanisme de régulation du système Wnt/Fzd.................................................... 54
2. Wnt inhibitory protein, Dickkopf et WISE/SOST ................................................... 54
B. Agonistes de Wnt ......................................................................................................... 55
V. Implication de Frizzled 4 et Dishevelled 3 dans l’activation des voies de signalisation . 55
A. Frizzled4....................................................................................................................... 55
B. Dishevelled3................................................................................................................. 56
C. Données connues sur le partenariat entre Frizzled4 et Dishevelled3........................... 57
Chapitre II Morphogenèse de l’arbre vasculaire................................................................... 58
I. Présentation générale........................................................................................................ 58
II. Organisation générale du système vasculaire 59
A. Les vaisseaux de gros calibre ....................................................................................... 59
B. Les vaisseaux de moyen et petit calibre ....................................................................... 61
C. Mécanismes cellulaires de la morphogenèse vasculaire .............................................. 63
1. La vasculogenèse...................................................................................................... 63
2. L’angiogenèse .......................................................................................................... 64
a) Vasodilatation, perméabilité vasculaire et dégradation de la MEC ..................... 64
b) Prolifération et migration des CE......................................................................... 65
c) Structuration des vaisseaux .................................................................................. 66
(1) Régulation des cellules apicales ou « tip cells »............................................ 67
(2) Régulation des « stalk cells » 68
d) Formation des tubes endothéliaux........................................................................ 68
e) Différenciation artério-veineuse........................................................................... 69
f) Remodelage vasculaire......................................................................................... 70
3. L’artériogenèse......................................................................................................... 71
III. Facteurs impliqués dans le développement vasculaire................................................. 72
A. Basic Fibroblast Growth factor ou bFGF..................................................................... 73
1. Le système ligand /récepteur du bFGF .................................................................... 73
2. Voies de signalisation activées par le bFGF ............................................................ 74
3. Rôle du bFGF dans le développement vasculaire .................................................... 75
4. La signalisation bFGF et le système Wnt/Fzd ......................................................... 77
B. =-.1>?%-&01,#6-%@/A#B.$/%-5:#%C#=6B5:#;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;#DE
1. F%0">#*"#>0,1.(0>./0%1#*C#=6B5:#*+'"1*.1/">#*">#7&.*#;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;#DE
2. Voies de signalisation du TGF-! indépendantes des Smad ..................................... 81
3. GH("#*"#(.#>0,1.(0>./0%1#=6B5:#*.1>#("#*+I"(%''"&"1/#I.>$C(.0-"#;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;#<J
4. !.#>0,1.(0>./0%1#=6B5:#"/#("#>K>/L&"#M1/NBO*#;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;#<P
C. Implication du système Wnt/Fzd au niveau vasculaire................................................ 88
1. Analyse génétique du système Wnt/Frizzled dans le développement du réseau
vasculaire.......................................................................................................................... 88
2. Expression des partenaires du système Wnt/Fzd et activité dans les cellules
vasculaires ........................................................................................................................ 90
3. Les gènes cibles de Wnt codant pour des régulateurs angiogéniques...................... 93
5PRESENTATION DES RESULTATS.................................................................................... 94
Partie I : Etude des cellules souches mésenchymateuses dans l’angiogenèse via le système
Wnt/Fzd.................................................................................................................................... 95
I. Implication de sFRP1 dans la régulation des propriétés des MSC durant l’angiogenèse 97
II. Effet du préconditionnement des MSC en hypoxie 1% d’O sur la régénération2
vasculaire.................................................................................................................................. 99
III. Conclusion et discussion ............................................................................................ 102
Partie II : Implication du récepteur Frizzled 4 dans la régulation de la morphogenèse
vasculaire et participation de la protéine centrale Dishevelled .............................................. 105
I. Implication de Frizzled4 dans la régulation des propriétés des cellules vasculaires ..... 107
II. Implication de Fzd4 dans la formation des vaisseaux.................................................... 109
A. Matériels et méthodes................................................................................................. 109
1. Analyses in vivo ..................................................................................................... 109
a) Génotypage des souris WT et KO...................................................................... 109
b) Analyse immunohistochimique.......................................................................... 109
(1) Marquage Xgal sur tissus ............................................................................. 109
(2) Marquage des érythrocytes........................................................................... 110
(3) Marquage sur coupes in toto......................................................................... 110
c) Analyse du réseau artériel par microscanner...................................................... 111
(1) Préparation du produit de contraste et injection de l’animal ........................ 112
(2) Acquisition et analyse des images ................................................................ 112
d) Analyse des paramètres cardiaques, rénaux et vasculaires ................................ 113
e) Analyse génomique par MicroArray.................................................................. 114
2. Analyses in vitro..................................................................................................... 115
a) Culture cellulaire ................................................................................................ 115
(1) Isolement de cellules primaires .................................................................... 115
(a) Isolement de cellules endothéliales primaires à partir de reins de souris . 115
(b) Isolement de cellules musculaires lisses primaires à partir d’aortes de souris
115
(c) Isolement de MEF (Murine Embryonic Fibroblasts)................................ 116
(2) Mise en culture des cellules.......................................................................... 116
(3) Transfection des cellules .............................................................................. 117
(4) Traitement des cellules ................................................................................. 119
b) Tests fonctionnels............................................................................................... 119
(1) Prolifération cellulaire .................................................................................. 119
(a) Comptage cellulaire 119
(b) Incorporation du BrdU dans les cellules................................................... 119
(c) Etude du cycle cellulaire par cytométrie de flux....................................... 120
(2) Migration cellulaire ...................................................................................... 120
(a) Migration par chimiotactisme ................................................................... 120
(b) Migration sur strie (Wound healing)......................................................... 121
(c) Migration non directionnelle par vidéo microscopie ................................ 121
(d) Polarisation du Golgi ................................................................................ 121
6(e) Différenciation des cellules endothéliales en tubes endothéliaux............. 122
c) Détection des protéines ...................................................................................... 123
(1) Western Blot ................................................................................................. 123
(2) Immunofluorescence .................................................................................... 125
(3) Activité luciférase......................................................................................... 127
d) Détection des ARN messagers ........................................................................... 129
(1) Extraction des ARN totaux et dosage........................................................... 129
(2) Transcription inverse 129
(3) PCR quantitative........................................................................................... 129
3. Mise au point des outils.......................................................................................... 131
a) Caractérisation des cellules primaires ................................................................ 131
(1) Cellules endothéliales rénales primaires....................................................... 131
(2) Cellules musculaires lisses aortiques primaires............................................ 131
b) Validation par qPCR de l’inhibition du gène fzd4 par ARN interférence dans les
HMEC-1 et les MEF .................................................................................................. 132
4. Double hybride....................................................................................................... 133
a) Principe du double hybride ................................................................................ 133
b) Procédure expérimentale .................................................................................... 134
(1) 4(%1.,"#*"#(.#$%1>/-C$/0%1#QI(9RQST#*.1>#("#I"$/"C-#.''U/#'6V8=D#;;;;;;#W9X
(2) Double hybride ............................................................................................. 136
(3) Extraction des clones obtenus....................................................................... 138
B. Résultats ..................................................................................................................... 139
1. Analyse in vivo de l’implication de Fzd4 dans la régulation de la morphogenèse
vasculaire........................................................................................................................ 139
a) Profil d’expression vasculaire de Fzd4 .............................................................. 139
b) Effet de la délétion de fzd4 sur le réseau artériel................................................ 141
c) Effet de la délétion de fzd4 sur la densité vasculaire et l’organisation des
vaisseaux .................................................................................................................... 145
d) Effet de la délétion de fzd4 sur les fonctions cardiaque et rénale....................... 147
(1) Effet de la délétion de fzd4 sur la fonction cardiaque .................................. 147
(2) Effet de la délétion de fzd4 sur la fonction rénale........................................ 148
e) Effet de la délétion de fzd4 sur les paramètres vasculaires ................................ 149
(1) Analyse des propriétés mécaniques d’une grosse artère, la carotide............ 149
(2) Analyse de la réactivité artérielle de petites artères ..................................... 150
2. Analyse in vitro du rôle de Fzd4 sur les propriétés fonctionnelles des cellules
vasculaires ...................................................................................................................... 153
a) Rôle de Fzd4 sur la prolifération des cellules vasculaires ................................. 154
b) Rôle de Fzd4 sur la migration et la polarisation des cellules vasculaires .......... 156
(1) Effet de la délétion de fzd4 sur la migration des cellules vasculaires 156
(2) Effet de la délétion de fzd4 sur la polarisation des cellules vasculaires....... 158
c) Rôle de Fzd4 sur la différenciation des cellules endothéliales........................... 161
3. Mécanismes moléculaires régulés par Fzd4........................................................... 162
a) Analyse de la modulation des gènes induite par la délétion de fzd4 .................. 162
(1) Analyse génomique par MicroArray ............................................................ 162
(2) Analyse transcriptionnelle par PCR quantitative.......................................... 166
b) Implication de Fzd4 dans la régulation d’autres voies de signalisation............. 168
(1) Implication de Fzd4 dans la régulation du cycle cellulaire via le facteur de
transcription E2F1 .................................................................................................. 168
(2) S&'(0$./0%1#*"#BO*X#*.1>#(.#-+,C(./0%1#*"#(.#>0,1.(0>./0%1#=6B5:#;;;;;;;;;;;;;;;#WPE
7(3) Implication de Fzd4 dans la régulation de la signalisation bFGF ................ 171
C. Conclusion, discussion et perspectives ...................................................................... 173
III. Résultats préliminaires sur l’étude du partenaire intracellulaire de Fzd4, la protéine
centrale Dishevelled3 ............................................................................................................. 182
A. Résultats préliminaires sur l’analyse du partenariat entre Fzd4 et les isoformes de Dvl
182
1. Localisation de Dvl1, Dvl2 et Dvl3 ....................................................................... 182
a) Localisation des 3 isoformes de Dvl sous Fzd4 ................................................. 182
b) Localisation des 3 isoformes de Dvl sous Fzd7 187
2. Analyse du partenariat Fzd4-Dvl dans l’activation de la voie canonique.............. 188
a) Activation de la voie canonique sous Fzd4 et Dvl1/3........................................ 188
a) Activation de la voie canonique sous Fzd7 et Dvl3 ........................................... 191
3. Analyse de l’implication du domaine DIX de Dvl3 dans son interaction avec Fzd4
192
B. Perspective de recherche des partenaires intracellulaires de Dvl3............................. 193
C. Conclusions et perspectives ....................................................................................... 194
1. Partenariat entre Fzd4 et les isoformes 1 et 3 de Dvl............................................. 194
2. Recherche de partenaires intracellulaires de Dvl3 ................................................. 196
CONCLUSION GENERALE ................................................................................................ 200
ANNEXE ............................................................................................................................... 203
E2F1 dans le cycle cellulaire.................................................................................................. 204
I. Les rôles opposés de E2F1 ............................................................................................. 204
A. Activateur du cycle cellulaire..................................................................................... 205
B. Répresseur du cycle cellulaire.................................................................................... 205
II. YJBW#"/#("#>K>/L&"#M1/N:5$./+101"#;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;#JZP
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 208
PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS ....................................................................... 236
I. COMMUNICATIONS................................................................................................... 237
II. PUBLICATIONS ........................................................................................................... 239
8