Etude Structurale par RMN hétéronucléaire du pseudopilus de Pseudomonas aeruginosa, un composant essentiel de la machinerie de sécrétion de Type II : le paradigme pseudopilus/piston, Structural study by Heteronuclear NMR of the pseudopilus of Pseudomonas aeruginosa, the main component of tge Type II secretion system : the pseudopilus/piston paradigm

Sébastien Alphonse

Description

Sous la direction de Herve Darbon, Cédric Bernard
Thèse soutenue le 08 janvier 2010: Aix Marseille 2
Les bactéries à Gram négatif sont caractérisées par une organisation complexe de leur enveloppe,impliquant une membrane interne (ou cytoplasmique), un espace périplasmique et une membrane externe. Si le transport de petits composés chimiques se fait facilement, la sécrétion des protéines et des toxines nécessite par contre l’utilisation de machineries spécialisées : les systèmes de sécrétion.Chez Pseudomonas aeriginosa, une bactérie pathogène opportuniste, le système de sécrétion de Type II, ou sécrétion Xcp, constitue l’une des voies principales de la sécrétion. Ce sécréton Xcp est un complexe macromoléculaire de 12 protéines, nommées XcpAO et XcpPC-ZM, organisé en trois sous-complexes : une plateforme d’assemblage ancrée dans la membrane interne (XcpPC-SF etXcpYL-ZM), un pore localisé dans la membrane externe et formé par multimérisation de la sécrétine XcpQD, et un pseudopilus périplasmique impliquant les pseudopilines XcpTG-XK. Au travers de son introduction bibliographique, ce manuscrit présente les différents constituants de cette machinerie et leur implication dans la sécrétion. Un grand nombre de copies du constituant majoritaire de ce système, XcpTG, s’assemble sous forme d’un pseudopilus dont les cycles d’assemblage –désassemblage, semblables aux mouvements d’un piston, pourraient permettre la sécrétion des substrats à travers la membrane externe. Le travail effectué au cours de cette thèse a pour but d’approfondir la compréhension des conditions d’assemblage du pseudopilus, qui s’avère être une étape cruciale dans la sécrétion. Les résultats obtenus s’articulent autour de la détermination par RMN hétéronucléaire de la structure de XcpTG, le composant majoritaire du pseudopilus etre présente le premier constituant de la machinerie de type II de P. aeruginosa à voir sa structure résolue par RMN.
-RMN Hétéronucleaire
-Pseudomonas aeruginosa
-Pseudopilus
-Systeme de secretion
-Structure
-Secretion
Gram negative bacteria are characterized by a complex organisation of their cell envelope, with aninner membrane (or cytoplasmic membrane), a periplasmic space and an outer membrane. Incontrast to the transport of chemical compounds, which is preformed usually by porins localized inthe impermeable cell envelop, secretion of proteins and toxins requires specialized machineries: thesecretion systems. In Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen, among the wide rangeof section systems, the Type II secretion system, called Xcp secreton, is a major pathway for therelease of virulence factors. This Xcp secreton is a macromolecular complex involving 12 proteinscalled XcpA0 and XcpPC to XcpZM. This machinery is organized in 3 complexes, the assemblyplatform anchored in the inner membrane (implicating XcpPC,RE,SF,YL and ZM), the pore localizedin the outer membrane and formed by multimerization of the secretin XcpQD, and the periplasmicpseudopilus involving XcpTG-XK matured by the prepilin peptidase XcpAO. The introduction of thismanuscript presents all the components of the type II secretion system and their principal functionin the secretion process. XcpTG, the major components of this system, seems to polymerize to allowtransfer of secretion products across the outer membrane by a piston-like process. The workpresented in this manuscript is underlined by the idea of improving the understanding of themecanism of the type II secretion. The results articulate around the heteronuclear NMR solutionstructure determination of the XcpTG, which represents the first structure obtained for a componentof the type II secretion system of P. aeruginosa.
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22014/document

Sujets

• Sécrétion

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 31
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 42 Mo

Extrait

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier Yves Bourne, le Directeur du Laboratoire d’Architecture et
Fonction des Macromolécules Biologiques qui m’a permis d’effectuer ma thèse au sein de l’unité.

Je remercie également les membres du jury qui ont gentiment accepté de juger ce travail

Je souhaiterais maintenant remercier tout particulièrement l’équipe de RMN structurale de
l’AFMB, où j’ai passé quatre années excellentes.
Tout d’abord un grand merci à Hervé Darbon mon directeur de thèse, de m’avoir accueilli et
guidé dès mon Master 2 recherche.
Je remercie chaleureusement Cèdric Bernard qui a codirigé mes travaux. Cèd merci pour
m’avoir encadré depuis mon M2, merci également pour ta patience, ta disponibilité, pour tes
conseils et tes petites notes d’humour.
Un grand merci également à Badr, pour ces nombreuses astuces « paillasse », sa bonne humeur
et grâce à qui les nuits au labo ont été nettement moins déprimantes. Merci également à Kaou, pour
sa bonne humeur quotidienne, son amitié et ses encouragements.

Je voudrais également remercier toute l’équipe du LISM de l’IBSM de m’avoir accueilli pendant
ma première année de thèse. Un immense merci à Romè Voulhoux pour tout ce qu’il a pu
m’apprendre durant mes premiers mois de thèse, pour sa patience, sa disponibilité et son
optimisme et surtout pour tout ses précieux conseils.

Je remercie également Micka, Alex, Pada, Stef, Véro, Marion, Marie-Cécile, Loïc et Benji pour
leur amitié, leur humour, leurs conseils et tout ce qu’ils ont pu m’apporter pendant ces 4 années.

Je voudrais également remercier toutes les personnes qui ont rendu ce travail possible,
notamment Olivier Bornet qui a été d’une aide précieuse pour l’enregistrement des spectres.

Finalement je voudrais remercier affectueusement ma Famille, pour m’avoir toujours soutenu et
supporté malgré mon « sale » caractère. Donc un grand merci à ma mère Martine, à mon frère
Christophe et ma sœur Vanessa pour leur présence. Merci à Ber et Cloclo et un grand merci à Eve
et Jo qui ont été d’une grande aide durant la fin de ma thèse. Une profonde pensée à ma grand-
mère Jeanne et merci à tous de si bien m’entourer malgré tout.
I II Avant Propos

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène responsable de 10% des maladies
nosocomiales. Ceci fait de cette bactérie un véritable fléau au sein des infrastructures hospitalières.
Cette bactérie cause également de nombreuses infections chez les malades atteints de
mucoviscidose, les grands brûlés ou les personnes immunodéprimées. Une meilleure connaissance
des mécanismes impliqués dans la virulence de cette bactérie apporterait une aide précieuse à la
lutte contre ce problème de santé publique d’importance.
Parmi la grande variété de facteurs impliqués dans la pathogénicité, une multitude d’enzymes
biodégradatives et de toxines sont prises en charge par un système spécifique : l’appareil de
sécrétion de type II qui représente ainsi un facteur de virulence.
Les études fondamentales effectuées au cours de cette thèse ont été réalisées dans l’idée
d’améliorer encore la connaissance et la compréhension du mécanisme de sécrétion de Type II.
L’intérêt a été mis sur l’un des constituants essentiels de cette machinerie, le pseudopilus. Cette
structure, formée par la répétition hélicoïdale d’une protéine appelée pseudopiline, permettrait par
des cycles d’assemblage, désassemblage de pousser les différents substrats vers le milieu extérieur,
de façon similaire aux mouvements d’un piston.
Au travers de son introduction bibliographique, ce manuscrit présente la bactérie P. aeruginosa
et la panoplie de mécanismes de sécrétion dont elle dispose pour libérer certains facteurs de
virulence. L’emphase sera ensuite mise principalement sur l’architecture et le mécanisme du
système de sécrétion de Type II et de son pseudopilus qui se trouve être un composant essentiel à
cette machinerie. La dernière partie traitera de la méthode utilisée pour l’étude structurale du
pseudopilus, la résonance magnétique nucléaire. Nous limiterons la présentation de la méthode
utilisée au point de vue pratique, avec notamment les différentes étapes nécessaires à la résolution
d’une structure.
Ensuite, la dernière partie présentera les résultats obtenus durant ces trois années de thèse, à
savoir la détermination de la structure du composant principale du pseudopilus du système de type
II de P. aeruginosa, et la détermination du réseau d'interactions entre les différents composants de
ce système. Enfin, à l'issue de la présentation des résultats, je décrirai les derniers travaux toujours
en cours de réalisation
III IV Table des Matières
INTRODUCTION _____________________________________________________________ - 1 -
Le Contexte Biologique _____________________________________________________________ - 1 -
I. Pseudomonas aeruginosa : Un Modèle de Référence ___________________________________ - 3 -
A. Caractéristiques Générales ___________________________________________________________ - 3 -
B. Un Pathogène Opportuniste __________________________________________________________ - 4 -
1. Un organisme multirésistant : Formation du biofilm pour une implantation durable _________ - 5 -
2. Un Pathogène virulent _________________________________________________________ - 7 -
i. Facteurs de virulence de surface ______________________________________________ - 7 -
ii. Facteurs de virulence sécrétés ________________________________________________ - 9 -
3. Sécrétion des facteurs de virulence : Diversité des solutions disponibles _________________ - 12 -
i. Système de Sécrétion de Type I ______________________________________________ - 14 -
ii. Système de Sécrétion de Type II ____________________________________________ - 15 -
iii. Système de Sécrétion de Type III ___________________________________________ - 18 -
iv. Système de Sécrétion de Type IV ___________________________________________ - 19 -
v. Système de Sécrétion de Type V ____________________________________________ - 21 -
vi. Système de Sécrétion de Type VI ___________________________________________ - 24 -
II. Les systèmes de sécrétion de type II : Le Sécréton Gsp _______________________________ - 27 -
A. Première étape de sécrétion : Le Franchissement de la membrane interne _____________________ - 27 -
1. La machinerie Sec ___________________________________________________________ - 27 -
i. Pré-requis pour l’utilisation de la voie Sec _____________________________________ - 28 -
ii. Adressage de la préprotéine au translocon Sec : _________________________________ - 29 -
a. SecB _____________________________________________________________ - 29 -
b. SecA _____________________________________________________________ - 30 -
c. Le canal de translocation _____________________________________________ - 32 -
d. Modèle de Mécanisme _______________________________________________ - 34 -
2. La machinerie Tat ___________________________________________________________ - 36 -
B. Deuxième étape de sécrétion : le Sécréton ______________________________________________ - 39 -
1. Point de vue Génomique ______________________________________________________ - 39 -
2. Protéines du Système de sécrétion de type II _______________________________________ - 41 -
i. La Plateforme d’assemblage ________________________________________________ - 42 -
a. GspE ____________________________________________________________ - 42 - R
b. GspL ____________________________________________________________ - 45 - Y
c. Interaction entre GspE et GspL _______________________________________ - 47 - R Y
d. GspM ___________________________________________________________ - 49 - Z
e. GspF ____________________________________________________________ - 53 - S
f. GspC ____________________________________________________________ - 55 - P
g. Modèle d’assemblage de la plateforme __________________________________ - 57 -
ii. Les constituants du pseudopilus _____________________________________________ - 58 -
V a. La Prépiline peptidase _______________________________________________ - 58 -
b. La Pseudopiline Majeure GspG _______________________________________ - 59 - T
c. Les Pseudopilines Mineures GspH -I -J