Evaluation of the role of mitochondrial citrate synthase, mitochondrial and cytosolic isoforms of isocitrate dehydrogenase in tomato leaf metabolism [Elektronische Ressource] / von Agata Sienkiewicz-Porzucek

Agata Sienkiewicz-Porzucek

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• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 28
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 3 Mo

Extrait

Evaluation of the role of mitochondrial citrate synthase,
mitochondrial and cytosolic isoforms
of isocitrate dehydrogenase in tomato leaf metabolism
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat)
im Fach Pflanzenphysiologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humbold-Universität zu Berlin
von
M.Sc. Agata Sienkiewicz-Porzucek (Sienkiewicz)
geb. 12.09.1979 Lubsko, Polen
Präsident der Humbold-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter/innen:
1. Prof. Dr Bernhard Grimm
2. Dr Michael Hodges
3. Dr Alisdair Fernie
Tag der mündlichen Prüfung: 08 Dezember 2009
Eidesstattliche Erklärung
This Ph.D. thesis is the result of my own work and was done between January
2004 and March 2007 in the department of Prof. Dr. Lothar Willmitzer at the
Max-Planck-Institute of Molecular Plant Physiology in Golm, Germany. It has not
been submitted for any degree or Ph.D. at any other university.
Die Dissertation ist das Ergebnis praktischer Arbeit, welche von Januar 2004 bis
März 2007 durchgeführt wurde im Department von Prof. Dr. Lothar Willmitzer im
Max-Planck-Insitut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Golm, Deutschland. Ich
versichere, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig verfaßt und keine anderen
als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Diese Dissertation
wurde an keiner anderen Hochschule zu Prüfung eingereicht.
Berlin, September 2009
Agata Sienkiewicz-Porzucek
2
Zusammenfassung
Der Citratzyklus (TCA) ist einer der bedeutendsten Stoffwechselwege für alle
lebenden Organismen. Trotz der zentralen Rolle dieses Prozesses im
Pflanzenmetabolismus ist er nur relativ wenig untersucht worden. In dieser Arbeit
berichte ich über die Produktion und die funktionale Analyse von
Tomatenpflanzen (Solanum lycopersicum), die unabhängig eine leicht
eingeschränkte Aktivität der mitochondrialen Citrat-Synthase (CS) und zweier
Isocitrat-dehydrogenasen (mitochondriale NAD-IDH und cytosolische NADP-
ICDH) zeigen.
Pflanzen, die einen Teil der Citrat-Synthase (CS) in einer antisense Orientierung
exprimieren, wiesen mehrheitlich keine erkennbare Veränderung eines
Wachstumphänotyps auf. Obwohl die photosyntetische Leistung keine
Änderungen gezeigt hatte, war die mitochondriale Respiration gestiegen, begleitet
von einem reduzierten Kohlenstoff-fluss durch den Citratzyklus. Darüber hinaus
waren die CS Pflanzen charakterisiert durch wesentliche Änderungen im
Blattmetabolismus, einschließlich eines eingeschränkten Niveaus des
photosynthetischen Pigments und Zwischenprodukten des Citratzyklus
zusammen mit einer Akkumulation von Nitraten, verschiedenen Aminosäuren und
Stärken. Interessanterweise wurde die maximale katalytische Aktivität von einigen
im primären C und N Metabolismus beteiligten Enzymen reduziert.
Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse auf eine Einschränkung der Nitrat-
Aufnahme hin. Das mit Hilfe von TOM1 Mikroarrays und quantitativer RT-PCR
durchgeführte Transcript-profiling hat gezeigt, dass die fehlende Aktivität der
mitochondrialen CS teilweise von einer gestiegenen, peroxisomalen CS Isoform
ausgeglichen wird.
Die genetisch modifizierten Tomatenpflanzen, die ein Fragment der
Kodierungsregion der mitochondrialen NAD-abhängigen Isocitrat-Dehydrogenase
(NAD-IDH) in einer antisense Orientierung exprimieren, und Pflanzen mit einer
durch RNAi Ansatz geminderten Aktivität der zytologischen NADP-abhängigen
Isocitrat-Dehydrogenase (NADP-ICDH) haben leichte, phänotypische
Änderungen gezeigt, meistens in Form von reduziertem Fruchtwachstum.
Zusätzlich wurde auch bei NADP-ICDH Pflanzen ein verstärktes
Wurzelwachstum festgestellt. Die maximale Effizienz des Photosystems II ist in
beiden transgenen Genotypen leicht reduziert worden bei gleichzeitigem,
deutlichen Abfall im Niveau des photosynthetischen Chlorophylls und
Xantophylls. Trotzdem konnte eine klare Minderung des metabolischen
Kohlenstoff-Flusses durch den Citratzyklus und ein reduziertes Niveau der
Citratzyklus-Zwischenprodukte ausschliesslich in NAD-IDH Linien beobachtet
werden. Zusätzlich wurde in beiden NAD-IDH und NADP-ICDH Pflanzentypen
wesentliche metabolische Änderungen entdeckt, wie z.B. eine reduzierte
Stärkebiosynthese, Ansammlung von Nitrat und Veränderungen des Aminosäuren-
3
und Pyridinnukleotidgehaltes. Die metabolische Verschiebung, kombiniert mit
Veränderungen des zellularen Niveaus von Reduktionsäquivalenten ergab eine
Verstärkung der photorespiratorischen Leistung, die vermutlich eine
ausgleichende Rolle in der Produktion organischer Säuren und der
Wiederherstellung der Redox-Balance spielt. Interessanterweise zeigen beiden
Genotypen verschiedene Symptome von Störungen in der Nitratassimilation auf
enzymatischen, metabolischen, transcript und phänotypischen Ebenen auf. Die
metabolische Antwort von Blättern auf Stickstoffmangel war in transgenen
NADP-ICDH Pflanzen dramatischer als in NAD-IDH Pflanzen, was darauf
hindeutet, dass die cytosolische Isoform der Hauptlieferant von 2-Oxoglutarat im
Tomatenmetabolismus sein könnte.
Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse haben zu einem tieferen Einblick in
die funktionale Role der mitochondrialen Citratsynthase und auch der
mitochondrialen und cytosolischen Isocitrat-Dehydrogenasen im
Blattmetabolismus einer Modelpflanze (Solanum lycopersicum) geführt. Sie
haben das Bestehen einer zwischenorganellen Koordination des
Stoffwechselprozesses hervorgehoben und unser Verständnis der Kohlenstoff-
Stickstoff Wechselwirkung erhöht. Desweiteren haben die Ergebnisse die
Anwesenheit von Strategien nachgewiesen, durch die der Metabolismus bei
auftauchenden Mängeln umprogrammiert werden kann.

4
Abstract
The TCA cycle is a respiratory metabolic pathway of central importance for all
living organisms. Despite the vital function of this process in plant metabolism
relatively few molecular physiological studies were performed to date. Here, I
report the generation and functional analysis of tomato plants (Solanum lycopersi-
cum) independently displaying mildly limited activity of mitochondrial citrate
synthase (CS) and two isocitrate dehydrogenases, namely mitochondrial NAD-
IDH and cytosolic NADP-ICDH.
The plants expressing a fragment of mitochondrial citrate synthase (CS) in the
antisense orientation exhibited essentially no visible growth phenotype. Although
photosynthetic performance was unaltered, mitochondrial respiration was in-
creased and accompanied by limited carbon flux through the TCA cycle. Moreo-
ver, the CS transgenic plants were characterized by significant modifications in
the leaf metabolic content. They included limited level of photosynthetic pigments
and TCA cycle intermediates, in addition to accumulation of nitrate, multiple ami-
no acids and starch. Interestingly, the maximal catalytic activities of several en-
zymes involved in primary C and N metabolism were decreased. When taken to-
gether, these results hint towards limitations in nitrate assimilation pathway. The
transcript profiling performed by utilizing TOM1 microarrays and quantitative
RT-PCR approach revealed that the deficiency in mitochondrial CS activity was
partially compensated by upregulation of peroxisomal CS isoform.
The transgenic tomato plants expressing a fragment of mitochondrial NAD-
dependent isocitrate dehydrogenase (NAD-IDH) in the antisense orientation and
plants down regulated in the activity of cytosolic NADP-dependent isocitrate de-
hydrogenase (NADP-ICDH) via the RNAi approach revealed minor phenotypic
modifications, manifested mainly by compromised fruit production. Additionally,
NADP-ICDH plants displayed increased root formation. The maximal efficiency
of photosystem II was mildly reduced in both transgenic genotypes and accompa-
nied by significant decrease in the level of photosynthetic chlorophylls and xanto-
phylls. However, a clear reduction in the metabolic carbon flux through the TCA
cycle and reduced level of TCA cycle intermediates were observed exclusively in
the NAD-IDH transgenic lines. Furthermore, both NAD-IDH and NADP-ICDH
plants revealed large metabolic alterations, such as decreased starch biosynthesis,
accumulation of nitrate and modifications in amino acids and pyridine nucleotides
content. The metabolic shift combined with modifications in the cellular reducing
equivalent level resulted in upregulation of the photorespiratory pathway, which
presumably played a compensatory role in supporting organic acid production and
re-establishing redox balance. Interestingly, both transgenic genotypes exhibited
various symptoms of perturbations in nitrate assimilation on the enzymatic, meta-
bolic, transcript and phenotypic levels. The leaf metabolic response towards nitro-
gen starvation conditions