Expression and function of the connexin43G138R mutation in mice causing oculodentodigital dyplasia (ODDD) in human [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Radoslaw Dobrowolski

Radoslaw Dobrowolski

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: rheinische_friedrich-wilhelms-universitat_bonn
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 61
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

Expression and function of the
connexin43G138R mutation in mice
causing oculodentodigital dyplasia
(ODDD) in human
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
vorgelegt von
Radoslaw Dobrowolski
aus
Radom
Bonn, 2008Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlich en
Fakultät
der Rheinischen Friedrich-Wilhems-Universität Bonn
Erstgutachter: Prof. Dr. Klaus Willecke
Zweigutachter: Prof. Dr. Karl-Heinz Scheidtmann
Fachnahes Mitglied: Prof. Dr. Dieter Fürst
Fachangrenzendes Mitglied: PD Dr. Gerhild van Echten-Deckert
Tag der Promotion:..........................Erklärung
Hiermit versichere ich, dass diese Dissertation von mir selbst und ohne
unerlaubte Hilfe angefertigt worden ist. Es wurden keine ande ren als die
angegebenen Hilfsmittel benutzt. Ferner erkläre ich, dass die vorlie gende Arbeit
an keiner anderen Universität als Dissertation eingereicht wurde.
Bonn, März 2008
..........................................
Radoslaw DobrowolskiDanksagung
Herrn Prof. Dr. Klaus Willecke danke ich insbesondere für die Ü berlassung des
interessanten Themas, die eingeräumten Freiheiten bei der Bearbe itung der
Fragestellungen und die stete Unterstützung beim Aufbau von Kooperationen.
Herrn Prof. Dr. Karl-Heinz Scheidtmann danke ich für die Üb ernahme des
Koreferates.
Herrn Prof. Dr. Dieter Fürst und Frau PD Dr. Gerhild van Ech ten-Deckert danke
ich für die Bereitschaft der Promotionskommission als fachna hes und
fachangrenzendes Mitglied zur Verfügung zu stehen.
Für die freundliche und erfolgreiche Kooperation sowie das Vermi tteln neuer
Techniken möchte ich mich bei den folgenden Mitgliedern auswärtiger
Arbeitsgruppen bedanken: Dr. Philipp Sasse, Dr. Jan W. Schricke l, Dr. Alexander
Ghanem, Dr. Clemens Troatz, Prof. Dr. Bernd Fleischmann, Prof. Dr. Thorsten
Lewalter, PD Dr. Klaus Tiemann, Dr. Peter Bedner, Dr. Martin Theis, Dipl. Biol.
Hildegard Lechner (Bonn), MiDndr.au gas Rackauskas,Pro f. Dr. Feliksa s F.
Bukauskas (New York), Dr. Jung-Sun Kim (Seoul), Dr. Marcus W atkins, Prof. Dr.
Roberto Civitelli (St. Louis) und Hartmann Hartz (München).
Den ehemaligen und jetztigen Mitarbeitern des Instituts für Genetik danke ich für
stete Diskussions- und Hilfsbereitschaft bei wissenschaflichen und te chnischen
Fragen. Hierbei möchte ich besonders Dr. Markus Kretz, Dipl. Biol. Thorsten
Höher, Dipl. Biol. Robert Requardt und Dipl. Biol. Oliver Tre ss hervorheben.
Darüberhinaus möchte ich mich für die herzliche Atmosphäre bei allen
Mitarbeitern des Labors 712 bedanken, insbesondere jedoch bei Indra
Lübkemeier und Marina Frank.
Insbesondere möchte ich mich bei Gerda Hertig für die h ervorragende
technische Unterstützung bedanken. Annette Sommershof danke ich für die
erfolgreiche Zusammenarbeit an den mutanten Cx43 HeLa-Zellen. Fü r die Hilfe
bei der Erzeugung und Pflege Cx43 transgener Tiere danke ich Dr. Joachim
Degen.
Ein besonderer Dank gilt natürlich meiner Familie, die mich in jeder Situation
uneingeschränkt unterstützt hat. Table of contents
Table of contents
1. Introductio n 1
1.1 Gap junctions 1
1.1.1 Structure of gap junction channels 1
1.1.2 Functions of gap junction channels and hemichannels 3
1.1.3 Regulation of gap junction channels 4
1.2 Connexins in human and mouse 5
1.3 Connexin associated human disease 6
1.3.1 Connexin43 mutations lead to Oculodentodigital dysplasia (ODDD) 8
1.4 The mammalian heart 10
1.4.1 Gap junctions in the heart: expression and function 11
1.4.2 Disturbed cardiac conduction in connexin deficient mice 12
1.4.3 Gap junction alterations in human heart failure 13
1.5 General developmental processes in limb and bone 15
1.5.1 Development of the limb bud 15
1.5.2 Contribution of bone morphogenic proteins (Bmp) to limb bud
development and skeletogenesis 17
1.5.3 The impact of Cx43 containing gap junction channels on
morphogen expression 19
1.6 Mouse as model for human disease 20
1.6.1 Targeted insertion of a conditional gene mutation 20
1.6.2 The Cx43G138R targeting vector for conditional replacement
of Cx43 in mice 22
1.7 Aims of the study 24
2. Material 25
2.1 Plasmids 25
2.2 Bacterial strains 26
2.3 Eukaryotic cell lines 26
2.4 Transgenic mouse strains 27
2.5 Primers 28
2.5.1 Primers for mice genotyping 28 Table of contents
2.5.2 Primers for real-time RT-PCR analyses 28
2.6 Antibodies 29
2.6.1 Primary antibodies 29
2.6.2 Secondary antibodies 30
3. Method s 31
3.1 Generation and analysis of Cx43G138R conditionally
expressing mice 31
3.1.1 Generation, genotyping and Northern blot analysis of Cx43G138R
transgenic mice 31
3.1.2 Morphologic abnormalities in Cx43G138R heterozygous mice
equal those in ODDD patients 33
3.1.3 Bone and cardiac morphology of Cx43 +/G138R mice 33
3.1.3.1Tissue preparation, fixation and sectioning 33
3.1.4Immunoblot analysis and immunoprecipitation 34
3.1.5 The Cx43G138R mutation frequently results in premature death
because of cardiac expression 34
3.1.6 Cardiac function in cardiac specific Cx43G138R mutants 35
3.1.6.1Electrophysiological examination and Langendorff measurements 35
3.1.6.2In vivo recordings of electrocardiograms and hypoxic stimulation 36
3.1.6 Echocardiography 36
3.2 Analysis of Cx43-/G138R hemizygously mutated mice 37
3.2.1 Simultaneous detection GFP and LacZ in mice tissues 37
3.2.2 Analyses of apoptosis in interdigital spaces 37
3.2.3Expression of diverse morphogens during development of limb bud 37
3.2.4Real-time RT-PCR analyses 38
3.2.5 Limb bud cultures 39
3.2.6 Immunofluorescence analyses of limb bud cultures 39
3.2.7 Calcium imaging 39
3.3 In vitro analyses of the Cx43G138R and other ODDD associated
Cx43 mutations 41
3.3.1 Tracer coupling of Cx43G138R expressing cells and
electrophysiological measurements of Cx43G138R channels 41
3.3.2 ATP release and dye uptake studies 41 Table of contents
3.3.3Contractions of cultured embryonic cardiomyocytes 43
3.3.4 Determination of the half-life of mutated and wild-type Cx43 proteins
by pulse chase analyses 43
323.3.5 P labeling of HeLa cells expressing Cx43G138R or wild-type Cx43 44
4. Result s 45
4.1 Generation and analysis of Cx43G138R conditionally
expressing mice 45
4.1.1 Morphologic abnormalities in Cx43G138R heterozygous mice
equal those in ODDD patients 46
4.1.2