Expression von lymphendothelialen Zellmarkern (LEZ) im Humanen Auge [Elektronische Ressource] = Expression of Lymphatic Endothelial Cell (LEC) markers in the human eye/ Kerstin Birke

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• Publié par: friedrich-alexander-universitat_erlangen-nurnberg
• Publié le: 01 janvier 2010
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Extrait

Expression von lymphendothelialen
Zellmarkern (LEZ) im Humanen Auge


Expression of Lymphatic Endothelial Cell (LEC)
Markers in the Human Eye



Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.



vorgelegt von

Kerstin Birke

aus München





Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg




























Tag der mündlichen Prüfung: 08.02.2010

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. J. H. Brandstätter
Zweitberichterstatterin: Prof. Dr. E. Lütjen-Drecoll




























„Immer wandle den kürzesten Weg. Er ist der natürliche; man folgt da im Reden und Tun
nur der gesunden Vernunft. Ein solcher Entschluss nämlich erspart dir Kümmernisse,
Kämpfe, Rücksichten jeder Art und Eitelkeiten.“
Marc Aurel, Selbstbetrachtungen 170-178
Table of contents
Table of contents
1. Zusammenfassung 1
2. Summary 2
3. Introduction 5
3.1 Ocular immune privilege 5
3.2 Aqueous humor outflow pathways 18
3.3 Lymphatic endothelial cell markers 24
3.4 Antigen-presenting cell migration 28
4. Purpose 31
5. Results 32
5.1 Control stainings for LEC markers and migration relevant chemokines 32
5.2 LEC marker expression in the iris 33
5.3 LEC marker expression in tissues of the uveoscleral outflow 39
5.4 LEC marker expression in trabecular meshwork tissue 41
5.5 Migration relevant chemokines in iris tissue 43
5.6 Migration relevant chemokines in trabecular meshwork tissue 48
5.7 PCR expression analysis of cultured human trabecular meshwork cells 49
5.8 Immunofluorescence staining on cultured TM cells 50
5.9 Chemokine microarray of mouse aqueous humor 51
5.10 Podoplanin in context of cell shape regulation 55
5.11 Podoplanin expression in the retina 56
6. Discussion 58
7. Materials and Methods 69
8. References 76
9. Abbreviations 88

Table of contents
Register
Figures:
Figure 1. Anatomical features of ocular immune privilege. 6
Figure 2. Overview of the cornea. 7
Figure 3. Scheme of the lens. 8
Figure 4. Vasculature of the ciliary body. 9
Figure 5. Ciliary epithelium. 10
Figure 6. Iris. 11
Figure 7. Layers of the human retina. 13
Figure 8. Time scale Scheme of the ACAID experiment. 16
Figure 9. Aqueous humor outflow pathways. 19
Figure 10. Drainage pathway via the conventional outflow tract from the
trabecular meshwork (TM), through Schlemm`s canal (SC) to the
venous plexus. 20
Figure 11. Layers of the trabecular meshwork. 20
Figure 12. Trabecular meshwork (TM) cells surrounding a trabecular beam (BM). 21
Figure 13. Subendothelium and Endothelium of Schlemm`s canal (SC). 22
Figure 14. Uveoscleral outflow pathway. 23
Figure 15. Stepwise model for the development of the mammalian lymphatic
vasculature. 26
Figure 16. Guidance of activated APCs in the lymph node. 29
Figure 17. Control stainings on human LNs. 32
Figure 18. PCR analysis of LEC marker expression in iris tissue. 33
Table of contents
Figure 19. Immunofluorescence stainings of LEC markers on human iris sections. 34
+Figure 20. Immunofluorescence analysis of Lyve-1 cells in human irides. 35
Figure 21. Immunoelectronmicroscopy analysis of Pdpn expression. 36
+Figure 22. Characterization of CD68 dendriform cells. 36
Figure 23. LEC marker stainings on Balb/c irides. 37
Figure 24. Flat mounts of Balb/c irides. 38
Figure 25. Double staining of Pdpn and Lyve-1 on Balb/c irides. 38
Figure 26. Double staining of F4/80 with Pdpn and Lyve-1. 39
Figure 27. Pdpn staining in the uveoscleral outflow. 40
Figure 28. Lyve-1 expression in the ciliary body. 40
Figure 29. PCR analysis of LEC marker expression in trabecular meshwork tissue. 41
Figure 30. Immunofluorescence staining of LEC markers in the trabecular
meshwork (TM). 42
Figure 31. Analysis of the cribriform region and the inner wall endothelium. 43
Figure 32. PCR analysis of chemokine ligand/receptor expression. 44
Figure 33. Immunofluorescence staining of Ccl21 and Pdpn in the iris. 44
Figure 34. Immunoflf CCR7, Ccl20 and CCR6 in the iris. 45
Figure 35. Immunofluorescence staining of chemokine receptors/ligands in mouse
irides. 46
Figure 36. In situ-hybridization for Ccl19 in the murine chamber angle region. 47
Figure 37. Double staining for Lyve-1 and chemokine receptors in the mouse iris. 47
Figure 38. PCR analysis of chemokine ligands and receptors in TM tissue. 48
Figure 39. Immunofluorescence staining of Ccl21 in the TM. 49
Table of contents
Figure 40. PCR analysis of mRNA expression of LEC markers and migration
relevant chemokines. 50
Figure 41. LEC marker stainings on cultured TM cells. 50
Figure 42. Double staining of Pdpn and Ccl21 on cultured TM cells. 51
Figure 43. Double staind Ccl20 on cultured TM cells. 51
Figure 44. Plot of the chemokine microarray data of 2 months old Bl/6, DBA/2J-
Rj, DBA/2J mice. 52
Figure 45. Plot of the chemokine microarray data of 10 months old Bl/6, DBA/2J-
Rj, DBA/2J without axonal loss and DBA/2J with axonal loss. 53
Figure 46. Comparison of chemokine microarray data of 2 and 10 months old
DBA/2J without axonal loss and DBA/2J with axonal loss. 54
Figure 47. Double stainings of Pdpn and cytoskeleton components in cultured TM
cells. 55
Figure 48. Pdpn expression in the retina of Balb/c mice. 56
Figure 49. Pdpn and CRALBP stainings on sections of cryo-embedded human
retinas. 57
Figure 50. Pdpn expression in the bovine retina. 57
Tables:
Table1. Structural features of the eye that contributes to immune privilege. 13
Table2. Cell surface molecules that contribute to ocular immune privilege. 15
Table 3. Aqueous humor factors that contribute to ocular immune privilege. 17
Table 4. LEC markers. 25


Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Das Auge ist immunologisch privilegiert, d.h. Transplantate können über längere Zeit in
der Augenvorderkammer verbleiben ohne abgestoßen zu werden. Streilein zeigte, dass
eine allergische Reaktion vom verzögerten Typ nach subkutaner Antigeninjektion aus-
bleibt, wenn das gleiche Antigen zuvor in die Augenvorderkammer injiziert wurde, ein
Phänomen, das er als „anterior chamber associated immune deviation“ (ACAID) be-
zeichnete. Nach Streilein ist ACAID nur dann auslösbar, wenn Antigen präsentierende
Zellen (APZ) den vorderen Augenabschnitt über das Trabekelwerk verlassen, von wo sie
über den venösen Abfluss, unter Umgehung regionärer Lymphknoten, direkt zur Milz
gelangen, wo die systemische Toleranz gegenüber den okulären Antigenen induziert wird.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, auf welche Weise APZs im Auge zu
den entsprechenden Abflusswegen geleitet werden. In anderen Organen übernehmen
Lymphendothelien durch Sekretion chemotaktischer Chemokine diese Aufgabe. Im Auge
fehlen Lymphgefäße, daher wurde untersucht, ob die Gewebe des vorderen Augenab-
schnittes Funktionen im Sinne einer aktiven Beteiligung an einem entsprechenden Trans-
portmechanismus übernehmen. Dazu wurde die Expression der Lymphendothelmarker
VEGFR3, Prox-1, Lyve-1 und Podoplanin, sowie der chemoattraktiven Chemokine
Ccl19, -20, und -21 und deren entsprechenden Rezeptoren CCR6 und -7 durch PCR-
Analysen an Iris und Trabekelwerkgewebe untersucht. Der Proteinnachweis und die Lo-
kalisation wurden durch Immunfluoreszenzfärbungen an Schnitten humaner und muriner
vorderer Augenabschnitte untersucht. Kammerwasserproben junger, ACAID-defizienter
DBA/2J Mäuse und älterer DBA/2J Mäuse, bei denen ACAID induzierbar ist, wurden in
Chemokin-Proteinarray-Analysen mit Proben gleichaltriger Kontrolltiere verglichen.
Lyve-1 war ausschließlich auf isolierten dendriformen Zellen im Irisstroma, im Ziliarköper
+und in den intertrabekulären Poren nachweisbar. Innerhalb der Iris waren die Lyve-1
Zellen gehäuft in Kapillarnähe lokalisert. Ein signifikanter Teil der Zellen koexprimierte
den Makrophagenmarker CD68. Einzelne Zellen im Irisstroma exprimierten auch Po-
+ - -doplanin (Pdpn), wobei die Mehrzahl der Pdpn Zellen Lyve /CD68 war. Eine deutliche
Markierung für Pdpn zeigte sich an den Zellen der Irisvorderfläche, den Zellen des Tra-
beculum ciliare und besonders ausgeprägt an den Trabekelwerkszellen. Prox-1 wurde nur
auf transkriptioneller Ebene in Trabekelwerks- und Irisgewebe nachgewiesen, während
VEGFR3 weder durch Färbungen noch durch PCR Analysen nachweisbar war. Das mig-
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