Folding and assembly of RuBisCO [Elektronische Ressource] : structural and functional characterization of the RuBisCO assembly chaperone RbcX / vorgelegt von Sandra Saschenbrecker

Sandra Saschenbrekcer

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 23
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Ludwig-Maximilians-Universität München
Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried



Folding and assembly of RuBisCO /
Structural and functional characterization
of the RuBisCO assembly chaperone RbcX



Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München






vorgelegt von
Sandra Saschenbrecker
aus Schwerin

2007
Erklärung
Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Absatz 3 bzw. 4 der Promotionsordnung vom
29. Januar 1998 von Herrn Prof. F. Ulrich Hartl betreut.





Ehrenwörtliche Versicherung
Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfsmittel erarbeitet.

München, am














Dissertation eingereicht am 25. Juni 2007
1. Gutacher Prof. Dr. F. Ulrich Hartl
2. Gutachter PD Dr. Konstanze F. Winklhofer
Mündliche Prüfung am 22. Oktober 2007
Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 2003 bis Juni 2006 in der Abteilung
Zelluläre Biochemie des Max-Planck-Instituts für Biochemie in Martinsried angefertigt.

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. F. Ulrich Hartl für die Bereitstellung des
interessanten Themas, seine intensive Förderung und Unterstützung sowie die
hervorragenden Arbeitsbedingungen.

Des Weiteren möchte ich mich herzlich bei Dr. Manajit Hayer-Hartl für ihre
hervorragende Betreuung, konstruktive Zusammenarbeit, ihr lebendiges Interesse an
meiner Arbeit und ihren stetigen Optimismus bedanken.

Ebenfalls gilt mein Dank Dr. Andreas Bracher. Seine Hilfe, Bemühungen und fachliche
Kompetenz insbesondere bei den kristallographischen und strukturanalytischen Arbeiten
sowie seine methodische Kreativität haben maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen.

Besonders danken möchte ich auch Dr. Enrico Schleiff and Dr. Thomas Becker für ihre
Kooperation und Hilfe sowie für norddeutsche Reminiszenzen.

Allen Mitarbeitern der Abteilung Zelluläre Biochemie danke ich für ihre kollegiale Hilfe
und die gute Arbeitsatmosphäre.

Mein herzlichster und größter Dank ist meiner Familie gewidmet. Ohne ihre
uneingeschränkte Unterstützung und ihren Rückhalt wäre diese Arbeit nicht möglich
gewesen.


CONTENTS I
CONTENTS


1 SUMMARY 1


2 INTRODUCTION 3
2.1 Protein structure 3
2.2 Protein folding 4
2.3 Protein folding and aggregation in vivo 5
2.4 Molecular chaperones 8
2.4.1 Chaperones involved in de novo protein folding 9
2.4.2 Ribosome-associated chaperones 10
2.4.3 The Hsp70 system 11
2.4.4 Prefoldin/GimC 13
2.4.5 The chaperonins 14
2.4.5.1 Structure and function of the E. coli chaperonin system
2.4.5.2 Mechanism of GroEL/ES mediated protein folding 16
2.4.5.3 Chloroplast (and cyanobacterial) chaperonins 19
2.5 Photosynthesis 22
2.5.1 Light-dependent reactions 23
2.5.2 Light-independent reactions / The Calvin cycle 25
2.6 RuBisCO 26
2.6.1 Reactions catalyzed by RuBisCO 26
2.6.2 Regulation of RuBisCO activity 28
2.6.3 Structure of RuBisCO 29
2.6.4 Folding and assembly of RuBisCO and the role of chaperones 33
2.6.5 RbcX 35
2.7 Aim of the study 36


3 MATERIALS AND METHODS 38
3.1 Materials 38
3.1.1 Chemicals
3.1.2 Reagent and purification kits 38
3.1.3 Strains 39
3.1.4 Plasmids, DNA and oligonucleotides
3.1.5 Enzymes, proteins, peptides and antibodies 40
3.1.6 Media 40
3.2 Instruments 41
3.3 Molecular biological methods 42
3.3.1 DNA analytical methods
3.3.2 Preparation and transformation of competent E. coli cells 43
3.3.2.1 Chemocompetent E. coli cells and chemical transformation
3.3.2.2 Electrocomcells and electroporation 43
CONTENTS II
3.3.2.3 TSS-transformation 44
3.3.3 Isolation of chromosomal DNA from Synechococcus sp. PCC7002
3.3.4 Purification of plasmid DNA and DNA-fragments 45
3.3.5 PCR (polymerase chain reaction)
3.3.6 Restriction digest and ligation 46
3.3.7 Cloning strategies 47
3.4 Protein biochemical and biophysical methods 49
3.4.1 Protein analytical methods
3.4.1.1 Protein quantification 49
3.4.1.2 SDS-PAGE
3.4.1.3 Tricine-PAGE 50
3.4.1.4 Native PAGE
3.4.1.5 Bis-Tris Native PAGE 51
3.4.1.6 SDS-PAGE analysis of Native PAGE protein bands
3.4.1.7 Coomassie blue staining of polyacrylamide gels 51
3.4.1.8 Silver staining of polyacrylamide gels 52
3.4.1.9 Phosphoimaging
3.4.1.10 Western blotting and immunodetection 52
3.4.1.11 Generation of antiserum 53
3.4.1.12 TCA precipitation
3.4.1.13 FFF-MALS 54
3.4.1.14 N-terminal sequencing of proteins
3.4.1.15 Sequence alignments 54
3.4.2 Protein expression and purification 55
3.4.2.1 AtCpn60 αβ
3.4.2.2 AtCpn60β 56
3.4.2.3 AtCpn60 α
3.4.2.4 AtCpn20, AtCpn10 and SoCpn20 57
3.4.2.5 PsCpn20
3.4.2.6 AtCpn20 , AtCpn20/N and AtCpn20/C 58 N-His6 His6 His6
3.4.2.7 Syn6301-RbcL S 58 8 8
3.4.2.8 Syn6301-RbcL 59 8
3.4.2.9 Syn6301-RbcS and Syn7002-RbcS 60 FLAG
3.4.2.10 Syn7002-RbcX and AnaCA-RbcX 61
3.4.2.11 (SeMet)-Syn7002-RbcX and (SeMet)-Syn7002-RbcX(∆C25) 61
3.4.2.12 Syn7002-RbcLX 62 N-His6
3.4.2.13 Syn6301-RbcL/AnaCA-RbcX 63 N-His6
3.4.3 Functional analyses
3.4.3.1 ATPase activity assay 63
3.4.3.2 Aggregation prevention assay 64
3.4.3.3 MDH refolding assay
3.4.3.4 RuBisCO refolding assay 65
3.4.3.5 Carboxylation activity assay for E. coli lysates 66
3.4.3.6 Proteinase K protection assay
3.4.3.7 Cycling of RbcL on GroEL 66
3.4.3.8 In vivo co-expression of RbcL or RbcLS with chaperones in E. coli 67
CONTENTS III
3.4.3.9 In vitro translation of RuBisCO 67
3.4.3.10 Co-immunoprecipitation 68
3.4.3.11 Analytical gel filtration of E. coli lysate or protein complexes 69
3.4.3.12 Crosslinking
3.4.3.13 Peptide binding assay 70
3.4.3.14 Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
3.4.4 Crystallography and Structure Analysis 71
3.4.4.1 Analytical subtilisin digest of Syn7002-RbcX
3.4.4.2 Tryptophan-fluorescence spectroscopy 71
3.4.3.3 ANS-fluorescence spectroscopy 72
3.4.4.4 Protein crystallization
3.4.4.5 Structure determination 74


4 RESULTS 76
4.1 In vitro analysis on reconstitution of type I RuBisCO 76
4.1.1 Characterization of RuBisCO as folding substrate
4.1.2 Structural characterization of chloroplast chaperonins and co-chaperones 78
used for in vitro studies
4.1.3 Functional characterization of GroEL, AtCpn60αβ, AtCpn60 β and their 79
interaction with various co-chaperones
4.1.4 Type I RuBisCO cannot be refolded in vitro 84
4.1.5 Analysis on the impediment in reconstitution of type I RuBisCO in vitro 84
4.1.5.1 GroEL binds unfolded Syn6301-RbcL, thereby preventing 84
aggregation
4.1.5.2 Syn6301-RbcL is encapsulated in the GroEL cage with properly 85
cycling GroES
4.1.5.3 Conformational changes of Syn6301-RbcL upon interaction with 87
the chaperonin system
4.1.5.4 Syn6301-RbcL is not released from GroEL as assembly-competent 90
protein
4.1.5.5 Syn6301-RbcL cycles on GroEL 91
4.2 Requirement of chaperonin for efficient production of assembled 92
Syn6301-RuBisCO in E. coli
4.3 Functional and structural characterization of RbcX 94
4.3.1 Sequential operation of GroEL/GroES and RbcX in assembly of Syn7002- 95
RuBisCO
4.3.2 Different requirement for RbcX in the assembly of RuBisCO from 98
Synechococcus sp. PCC6301 and Synechococcus sp. PCC7002
4.3.3 Further chaperone a