Function of Fra1 in mesenchymal stromal cell differentiation & the potential immune modulatory role of Fra1 [Elektronische Ressource] / von Frank Drießler

Drießler, Leonhard Frank

Description

Function of Fra1 in mesenchymal stromal cell differentiation & the potential immune modulatory role of Fra1 Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) im Fach Biologie Eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Humboldt-Universität zu Berlin Von Diplom – Biologe Frank Drießler geboren am 18.11.1975 in Bad Langensalza Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin: Prof. Dr. Christoph Markschies Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I: Prof. Dr. Christian Limberg Gutachter: 1. Prof. Saumweber 2. Prof. Lauster 3. Prof. Manz Eingereicht am: 09.04.2008 Tag der mündlichen Prüfung: 15.07.2008 2 Für mich. 3 4 Summary ______________________________________________________________________ Summary AP-1 transcription factor is a general name for multiple dimers formed by the association of Fos (or ATF) and Jun proteins. AP-1 acts as a sensor of changes in the cellular environment and thus, it is implicated in the modulation of cell proliferation, differentiation, transformation and cell death. Besides the well-documented role of c-Fos protein in oncogenesis, where this gene can function as a tumor promoter, AP-1 proteins are being recognized as regulators for mesenchymal stromal cell development and as regulators of immune cells.

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 207
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 9 Mo

Extrait

mal cell oFunction of Fra1 in mesenchymal strentiation & the potential immune differle of Fra1 omodulatory r

ion atertDisszur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium
nat.) . rer. (Drie goloi im Fach B

Eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin

e  Biologon DiplomVFrank Drießler geboren am 18.11.1975 in Bad Langensalza

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Christoph Markschies Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
erg n Limbristia. ChProf. Dr

Gutachter: 1. Prof. Saumweber
r eProf. Laust 2. Prof. Manz 3.

Eingereicht am: 09.04.2008
Tag der mündlichen Prüfung: 15.07.2008

2

3

Für mich.

4

Summary ______________________________________________________________________
Summary AP-1 transcription factor is a general name for multiple dimers formed by the
association of Fos (or ATF) and Jun proteins. AP-1 acts as a sensor of changes in the
cellular environment and thus, it is implicated in the modulation of cell proliferation,
differentiation, transformation and cell death. Besides the well-documented role of c-Fos
protein in oncogenesis, where this gene can function as a tumor promoter, AP-1
proteins are being recognized as regulators for mesenchymal stromal cell development
and as regulators of immune cells. The mesenchymal stromal cells are the common
progenitors for various mesenchymal lineages such as adipocytes, osteoblasts,
chondrocytes, myocytes and fibroblasts. AP-1 seems to play a key role in the control of
mesenchymal cell fate decision and differentiation. This is suggested by phenotypes of
mice with a genetic modifications in either the Jun or the Fos component of AP-1. In
particular, mice overexpressing the Fos-related antigen-1 (Fra1) or the short isoform of
FosB (delta[Δ]FosB) have been found to develop osteosclerosis due to an accelerated
differentiation of osteoblasts. Interestingly, mice overexpressing ΔFosB also developed
less fat tissue. The activity of Fos proteins can be regulated by post-transcriptional
modification. Based on knockout mouse model, a role for the growth factor regulated
kinase Rsk2 was proposed in the differentiation of mesenchymal stromal cells to
osteoblasts as well as in fat tissue development. Goal in this study was to identify the
molecular mechanisms explaining the differences between the wild type, fra1-tg, rsk2-
deficient and fra1-tg/rsk2-deficient phenotypes.
The comparison of the bones of the different mice genotypes revealed, that Fra1
and Rsk2 were independently regulating bone metabolism. Quantitative analysis of
adipocyte markers expressions, like PPARγ and C/EBPα, revealed, that Fra1
overexpression was blocking adipocyte maturation in vivo and in vitro. Moreover, the in
vivo results show that the fra1-tg/rsk2-/y mice develop a severe lipodystrophy. A milder
phenotype was observed in the parental fra1-tg strain but not in the Rsk2 knockout
strain. Additionally, it was been observed, that mesenchymal cells overexpressing Fra1
were resistant to glucocorticoid-induced growth inhibition. This effect can most likely be
explained by Fra1-mediated downregulation of the glucocorticoid receptor. Furthermore,
Fra1 overexpression influenced spleen development. Liver and heart analyses showed
that Fra1 overexpression induced collagen tissue. Diseases like cholangitis and fibrosis
tcome. the ouewer

5

Summary ______________________________________________________________________

6

assung fZusammen______________________________________________________________________
enfassung mZusam Aktivator Protein-1 (AP-1) ist ein kollektiver Terminus für dimerische
Transkriptionsfaktoren, die sich aus Fos- und Jun- Proteinen zusammensetzen. Diese
Untereinheiten binden an eine gemeinsame, spezifische DNA-Sequenz, die AP-1
Bindungsstelle. Zusätzlich zu der gut dokumentierten Rolle des c-Fos Proteins in der
Tumorgenese, wo dieses Gen als ein Aktivator beschrieben ist, übt AP-1 einen Einfluss
auf mesenchymale Stromazellen und Immunzellen aus. Mesenchymale
Knochenmarkszellen sind die Vorläuferzellen für Adipozyten, Osteoblasten,
Chondrozyten, Myozyten und Fibroblasten. Die molekularen Mechanismen, welche die
Differenzierungen regeln, sind noch weitgehend unerforscht. Der heterodimere
Transkriptionsfaktor AP-1 übt eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Zelldifferenzierung
aus. Verschieden genetisch veränderte Mausmodelle untermauerten dies. Mäuse,
welche das Fos-related antigen-1 (Fra1) oder eine kürzere Protein-Isoform von FosB
(delta[Δ]FosB) überexpremieren, entwickelten, durch eine beschleunigte Differenzierung
der Osteoblasten, eine Osteosklerose. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass
die transgenen ΔFosB Mäuse weniger Fett haben. Die Stabilität und Aktivität von Fos
Proteinen kann durch post-transkriptionale Modifizierungen geregelt werden. Basierend
auf knockout Mausmodellen, wurde eine tragende Rolle für das wachstumsregulierende
Enzym Rsk2 postuliert. Rsk2 spielt eine mögliche Rolle bei der Ausdifferenzierung von
mesenchymalen Vorläuferzellen zu Osteoblasten und Adipozyten. Das Ziel dieser Arbeit
war es molekulare Mechanismen zu finden, welche die unterschiedlichen Phänotypen
(wild typ, fra1-tg, rsk2-defizient und fra1-tg/rsk2-defizient) charakterisieren.
Die Knochenuntersuchungen der verschiedenen Genotypen zeigten, dass Fra1
und Rsk2, unabhängig voneinander, tragende Rollen im Knochenmetabolismus spielen.
Quantitative Analysen von Adipozytenmarker, wie PPARγ und C/EBPα, zeigten, dass
das Protein Fra1 die Adipozytenreifung in vivo und in vitro reguliert. Zusätzlich
entwickelten die doppel-mutierten fra1-tg/rsk2-/y Mäuse einen Lipodystrophy. Ein
milderer Phänotyp wurde in den fra1-tg Tieren beobachtet, jedoch nicht in den Rsk2-
knockout Mäusen. Zusätzlich wurde beobachtet, dass mesenchymale Zellen, welche
Fra1 überexprimieren, gegen Glucocorticoid-induzierte Wachstumshemmung resistent
waren. Diese Wirkung kann am wahrscheinlichsten durch die Fra1-vermittelte
Suppression des Glucocorticoidrezeptors erklärt werden. Außerdem beeinflusste die
Überexpression von Fra1 die Milzentwicklung. Leber und Herzanalysen zeigten, dass
Fra1 collagenhaltiges Gewebe induziert. Krankheiten wie Cholangitis und Fibrosen
waren die Folge.

7

assung fZusammen______________________________________________________________________

8

5 7 15

19 19 19 22 22 23 25 26 27 27 28 29 31 31 34 34 35 35 36 37 38 38 40

Table of Contents ______________________________________________________________________
Table of Contents Summary 5
Zusammenfassung 7
Abbreviation 15
19 Introduction 1. 1.1 Activator protein 1 (AP-1) 19
1.1.1. AP-1 transcription factor family 19
1.1.2. Characteristics of Fos family members and related mice models 22
1.1.2.1. Structure and function of c-Fos 22
1.1.2.2. Structure and Function of Fra1 23
1.1.2.3. Structure and Function of Fra2 25
1.1.2.4. Structure and Function FosB and delta(Δ)-FosB 26
1.2 From mesenchymal stromal cell to a tissue forming organ 27
1.2.1. Historical background of MSCs 27
1.2.2. Differentiation markers for mesenchymal stromal cells 28
1.2.2.1. Markers of osteoblast differentiation 29
1.2.2.2. Markers of chondrocyte differentiation 31
1.2.2.3. Markers of adipocyte differentiation 31
1.2.2.4. Markers of myocyte differentiation 34
1.3 Bone or fat development  is that the question? 34
1.3.1. Cellular structure of bone: osteoblast, osteocytes, osteoclast and
35 cytesdrochon1.3.1.1. Osteblast - the bone forming cell 35
1.3.1.2. Osteocyte 36
1.3.1.3. Osteoclast - the bone resorbing cell 37
1.3.1.4. Chondrocyte and chondrogenesis 38
1.3.2. How does bone formation work? 38
1.3.3. Function and characteristics of adipocytes tissue  BAT and WAT 40
2. Aims and Plan 45
2.1 Aims 45
2.2 Plan 46
3. Material 47
3.1 Mice animals 47
3.2 Cell material for ex vivo and in vitro experiments 47
3.3 Cell culture media and supplements 48
3.4 Buffer 49
3.5 Staining solutions 51
9

45 45 46

47 47 47 48 49 51

Table of Contents ______________________________________________________________________
3.6 Oligonucleotide 52
3.7 Antibodies 53
3.8 Molecular weight marker 54
3.9 Kits and enzymes 54
3.10 Chemicals 54
3.11 Consumables 56
3.12 Laboratory Instruments 56
58 Methods 4. 4.1 Cell culture 58
4.1.1. Splitting cells and cell density 58