Functional analysis of phototropin in Chlamydomonas reinhardtii [Elektronische Ressource] / von Yinghong Lu

Admin Pascal

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• Publié par: humboldt-universitat_zu_berlin
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 57
• Langue: Deutsch
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Extrait

1
Functional analysis of phototropin in
Chlamydomonas reinhardtii
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biochemie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Herr M.S. Yinghong Lu
geboren am 10.08.1975 in Nanjing, China
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Thomas Buckhout
Gutachter/innen: 1. Prof. Dr. Peter Hegemann
2. Prof. Dr. Maria Mittag
3. Prof. Dr. Wolfgang Lockau
Tag der mündlichen Prüfung: April 25, 20062
Erklärung
Hiermit erkläre ich, die vorliegende Arbeit selbständig ohne fremde Hilfe verfasst und nur die angegebene
Literatur verwendet zu haben.
Ich besitze keinen entsprechenden Doktorgrad und habe mich anderwärts nicht um einen Doktorgrad
beworben.
Die dem Promotionsverfahren zugrundeliegende Promotionsordung vom 01. Oktober 2002 ist mir bekannt.
Yinghong Lu 卢颖洪
2. Dezember 2005 3
Zusammenfassung
In höheren Pflanzen vermittelt der Blaulicht-sensitive Photorezeptor Phototropin verschiedene Reaktionen
wie Phototropismus, Chloroplastendrehung und die Öffnung von Schließzellen. Alle Reaktionen haben mit
der Optimierung der pflanzlichen Lichtaufnahme und damit einer angepaßten Photosynthese sowie der
Vermeidung von Lichtschädigung zu tun. In C.reinhardtii haben alle Phototropinreaktionen mit dem
Sexualleben dieser Alge zu tun, d.h. Gametogenese, sexueller Kompetenz sowie der Keimung von Zygoten.
Diese Doktorarbeit wurde Ende 2001 begonnen und verlief parallel zu den Arbeiten von Huang. Im
Unterschied zu den Ergebnissen von Huang war das Chlamydomonas Phototropin in meinen Händen
unlöslich. Das Protein war nicht komplett membranassoziiert, sondern ein Teil des Proteins blieb immer
löslich. Die Phototropinmenge sowie die Verteilung waren in vegetativen Zellen, die unter Stark- oder
Schwachlicht gewachsen waren, unterschiedlich.
Deshalb wurde für diesen Unterschied Licht als wesentlicher Faktor verantwortlich gemacht. Jedoch zeigen
verschiedene Stämme bei vegetativem Wachstum unter identischen Lichtbedingungen unterschiedliche
Phototropinmengen. Das deutet auf weitere Faktoren hin, die Konzentration und Verteilung von Phototropin
beeinflussen.
In Chlamydomonas wurde neben dem Volllängenprodukt noch eine c-terminal verkürzte Phototropinvariante
gefunden. Licht wurde als Verursacher der Verkürzung identifiziert. Aber nur lange Belichtungen von ca. 48 h
führten je nach Intensität zu klaren Abbaumustern. Für das Studium der Beteiligung des Phototropins am
Sexualleben von Chlamydomonas, sollte ein Phot- Stamm generiert werden. Dazu wurde ein RNAi-Konstrukt
hergestellt, mit dem es möglich war, im Stamm cw15 arg- A das Phototropin bis auf 10% des Originalniveaus
zu reduzieren. Leider funktionierte das Konstrukt in anderen Stämmen nicht zuverlässig. Im Stamm
CC32pab1mt(+) konnte nur ein Klon mit einer Reduktion auf 15% des Originalniveaus erreicht werden.
Außerdem war die Silencing-Effizienz stark von den Wachstumsbedingungen abhängig. Die beste Reduktion
wurde bei niedrigen Lichtintensitäten gefunden.
Es wurde ein weiterer Kreuzungstest etabliert, der für die Analyse der Zygotenkeimung verschiedene Vorteile
gegenüber bekannten Tests liefert. Aus den durchgeführten Tests konnte geschlossen werden, dass Licht
auch ein wesentlicher Faktor für die Zygotenkeimung ist. Bei mittleren Lichtintensitäten keimen Zygoten mit
wenig Phototropin später. Starklicht kann diesen Mangel weitgehend kompensieren.
Zur biochemischen Analyse des Phototropins in vitro war die Expression eines markierten Phototropins
notwendig. Zur Analyse des Phototropinabbaus und für die spätere Reinigung wurde auch versucht,
Phototropin in verschiedenen Gastorganismen zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde Phototropin in Xenopus
Oocyten und Diatomäen exprimiert. Diese Versuche haben bestätigt, dass das Phototropinabbauprodukt
vom selben Gen wie das Volllängenprotein resultiert. Durch Expression der Phot-Mutante S57S/C250S
konnte auch gezeigt werden, dass die Aktivierung des Phototropins keine Voraussetzung für den Abbau ist.
Erstmalig konnte auch Phototropin als Fusionsprotein in Chlamydomonas exprimiert werden. Das
Fusionsprotein wurde gereinigt und die Identität massenspektrometrisch verifiziert. Es wurde ein Stamm
gefunden, der nur eine verkürzte Variante des Phototropins exprimiert. Das Produkt war besser löslich als die
Volllängenversion. Eine Großproduktion sollte für die Reinigung und nachfolgende Kristallisation angesetzt
werden. Tandem Affinitätsreinigungen sollten für die Identifizierung von Reaktionspartnern durchgeführt
werden.4
Acknowledgments
I want to thank my supervisor, Prof. Peter Hegemann. It is because of you that I got to know this tiny but very
interesting little creature ---- Chlamydomonas. It is under your supervision, I understand more about science
research. With your help, I improved myself in many fields. Thank you so much!
I want to thank DFG and SFB for providing the financial support for this work.
I want to thank Alke, Christoph, Markus Heitzer, and Boris for spending time reading this thesis and giving
me valuable suggestions. Thank you!
I want to thank Nic and Nils, although you guys may not read this thesis. I am always grateful to you. You are
my friends, also my teachers. Thank you!
Thank you, Irina! Thank you for the help and suggestions you gave me! The discussions with you are really
helpful to me.
Thank you, Berti! In my four years staying in Regensburg, you gave me a lot of help. Thank you very much!
I also want to thank my other lab members and colleagues: Markus, Tina, Sabine, Norbert, Suneel, Gerhard,
Stanimir, Marion. Thank you for the help you gave me. I will always remember that!
I want to thank my parents. 爸爸,妈妈, 谢谢你们给我的鼓励和支持. 在我最彷徨无助的时候, 你们帮助我一
步一步建立自信, 勇敢的面对未来. 我会努力下去, 让你们为我骄傲!
Finally, I want to thank my wife. The four years is the most difficult period of time for us. Thank you for the
encouragement, support and love you gave me! We will work together to make our future! 5
Contents
Abbreviations.................................................................................................................................8
1 Summary...............................................................................................................................10
2 Introduction................11
2.1 Properties of phototropin................................................................................................12
2.2 Phototropin in Chlamydomonas reinhardtii....................................................................14
2.3 Chlamydomonas reinhardtii as host for recombinant protein expression......................18
2.4 RNA interference and gene silencing............................................................................20
2.5 The goal of C. reinhardtii mating assay.........................................................................24
3 Results..................................................................................................................................26
3.1 Localization and expression profile of Phototropin.......................................................26
3.1.1 Distribution and localization of phototropin.......26
3.1.2 Distributions of phototropin in different growth stages.........................................28
3.1.3 The degradation of phototropin is induced by light...............................................29
3.2 Reduction of the phototropin level in C. reinhardtii by RNAi..........................................31
3.2.1 The Phot1- RNAi construct...................................................................................31
3.2.2 Transformaiton of C. reinhardtii strain cw15 arg- A with the RNAi construct.......32
3.2.3 Transformation of C. reinhardtii strain CC32pab1mt(+) with phototropin RNAi
construct..................................................................................................................32
3.3 Mating Assay..................................................................................................................36
3.3.1 The design of mating assay.................................................................................36
3.3.2 Optimization of growth conditions for precultures before gametogenesis..........37
3.3.3 Mating assay results.............................................................................................39
3.4 Expression and purification of phototropin in different expression systems..................41
3.4.1 Expression of Phototropin in Oocytes..................................................................41
3.4.2 Fusion expression of Ble-Phot1 in C. reinhardtii .................................................44
3.4.3 Analysis of pLY2-A transformant No. 21..............................................................48
3.4.3.1 Distribution of the expressed product and the endogenous phototropin....48
3.4.3.2 Light induced degradation of the fusion protein.........