Functional and structural analysis of cell free produced transporters and G-protein coupled receptors [Elektronische Ressource] : development of new techniques for the fast and efficient production of integral membrane proteins / von Christian Klammt

Christian Klammt

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• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 37
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 13 Mo

Extrait

Functional and structural analysis of cell-free produced transporters
and G-protein coupled receptors: Development of new techniques for
the fast and efficient production of integral membrane proteins





Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften





vorgelegt beim Fachbereich
Biochemie, Chemie und Pharmazie (FB 14)
der Johann Wolfgang Goethe – Universität
in Frankfurt am Main







von
Christian Klammt
aus Frankfurt am Main


Frankfurt 2006
(D 30)2





















vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie (FB 14)
der Johann Wolfgang Goethe – Universität als Dissertation angenommen




Dekan: Prof. Dr. Harald Schwalbe
Gutachter: Prof. Dr. Volker Dötsch
Prof. Dr. Clemens Glaubitz
Datum der Disputation:




3
Danksagung
Ein herzliches Dankeschön gilt Dr. Frank Bernhard für die intensive und einzigartige
Betreuung und Förderung meiner Arbeit. Durch seine ständige Hilfsbereitschaft und
tatkräftige Unterstützung ist er sowohl wissenschaftlich als auch menschlich ein
Vorbild. Ich danke Ihm sehr für die Einblicke in seine wissenschaftliche Denkweise und
für seine Ideenvielfalt.
Meinem Doktor-Vater Prof. Dr. Volker Dötsch möchte ich herzlich für seine Förderung
und Unterstützung danken. Sein Engagement und seine Menschlichkeit haben mich
schwer beeindruckt. Volker wir schaffen die Kanzelwand unter 4 Minuten!
Herrn Prof. Dr. Clemens Glaubitz danke ich herzlich für seine Unterstützung und sein
offenes Ohr für jegliche Problemstellungen. Vielen Dank für die Übernahmen des
Zweitgutachtens!
Ich danke Prof. Dr. Heinz Rüterjans für seine stetige Unterstützung im Studium und
während meiner Diplom- und Doktorarbeit, für seine Förderung und für die
interessanten Gespräche. Ihm verdanken wir maßgeblich die Existenz und die
Ausstattung unseres NMR Zentrums.
I like to thank Dr. Vladimir A. Shirokov from the Institute of Protein Research RAS in
Pushchino for his help in establishing the individual cell-free expression system. I
benefited from his great knowledge about cell-free expression systems.
Ein herzliches Dankeschön an alle Mitglieder der Arbeitsgruppen Dötsch und Glaubitz
für die schöne gemeinsame Zeit, für die produktive Zusammenarbeit, für eine
freundschaftliche Atmosphäre und für all die gemeinsam verbrachten Stunden. Herrn
Dr. Frank Löhr (Murph) danke ich für die Aufnahme der NMR Experimente und gute
Zusammenarbeit, Sigrid Oguzer-Fachinger für ihre wunderbare Organisation und Birgit
Schäfer für ihre Hilfe im Labor, bei DNA Präparationen und für ihr stets offenes Ohr.
Besonders danke ich auch Daniel Schwarz, Birgit Schneider, Sina Reckel, Florian
Durst, Dr. Wesley McGinn-Straub, Tobias Weber, Mehdi Talebzadeh, Ines Lehner und
Daniel Basting für ihre Freundschaft, für interessante Gespräche und für ihre
Unterstützung bei der Arbeit und im privaten Bereich. Ich freue mich auf Euren Besuch
in Kalifornien!
Bei meinen Eltern und meiner ganzen Familie bedanke ich mich für ihre
immerwährende Unterstützung während meiner gesamten Ausbildung und darüber
hinaus. Außerdem möchte ich meinen Freunden und meiner Freundin Miriam für ihre
Zuneigung, ihr Verständnis, ihr Vertrauen und ihre Liebe danken.
4 CONTENTS
Contents
1. Summary..................................................................................................................9
2. Zusammenfassung.................................................................................................10
3. Introduction...........................................................................................................16
3.1. Overproduction of integral membrane proteins (IMPs)............................... 16
3.2. Cell-free expression techniques ................................................................... 18
3.2.1. Extract sources and preparation ....................................................... 19
3.2.2. Components and design of cell-free expression............................... 21
3.2.3. Applications.....................................................................................24
4. Results and Achievements....................................................................................27
4.1. Set-up of an individual cell-free system....................................................... 27
4.1.1. Cell-free protocol.............................................................................27
4.1.2. Analytical and preparative scale set-up............................................ 30
4.1.3. Cell-free modes of IMP expression.................................................. 32
4.2. Cell-free expressed IMPs 38
4.2.1. Reconstitution of cell-free expressed IMPs into proteoliposomes... 40
4.2.2. Activity assay of the α-helical transporters EmrE ........................... 41
4.3. Synergies of cell-free expression and high field NMR spectroscopy .......... 42
15 14.3.1. [ N, H]-TROSY-HSQC NMR measurements of IMP samples...... 44
4.3.2. Selectively cell-free isotopically labeling of IMPs and
combinatorial labeling...................................................................... 47
4.3.3. Protein-detergent interactions analyzed by NMR ............................ 49
4.3.4. Paramagnetic Resonance Enhancement (PRE) measurements ........ 50
4.3.5. Preliminary structural data of ΔTehA .............................................. 51

CONTENTS 5
5. Summary of publications.....................................................................................53
5.1. Establishment of high level cell-free expression of IMPs ............................53
5.1.1. Method development........................................................................53
5.1.1.1. High level cell-free expression and specific labeling of
IMPs (P 01)53
5.1.1.2. Soluble cell-free expression of IMPs in presence of
detergents (P 02)................................................................54
5.1.2. Reviews.............................................................................................56
5.1.2.1. Cell-free production of IMPs on a preparative scale
(P 03) .................................................................................56
5.1.2.2. Cell-free expression as an emerging technique for the
large scale production of IMP (P 04).................................57
5.1.2.3. Cell-free synthesis of IMPs for structural studies (P 05)...58
5.1.2.4. Preparative scale cell-free expression systems for
functional and structural studies (P 06) .............................59
5.1.2.5. DNA recombination and protein expression systems
(P 07) .................................................................................60
5.2. Unique labeling possibilities for IMPs by cell-free expression....................61
13 155.2.1. C- and N-isotopic labeling of proteins (P 08) .............................62
5.2.2. Efficient Strategy for the Rapid Backbone Assignment of IMPs
(P 09) ................................................................................................63
5.2.3. Combination of CF expression and NMR for structural
assignment of IMPs (P 10) ...............................................................64
5.2.4. Incorporation of Fluorescence Labels into cell-free produced
proteins (P 11) ..................................................................................65
5.3. FEBS Journal prize award of 2004 for Christian Klammt (P 12) ................66
6. Unpublished Results – Structural and functional analysis of the human
endothelin B receptor (ETB)................................................................................67
6.1. Introduction...................................................................................................67
6.1.1. G-protein coupled receptors (GPCRs)..............................................67
6.1.2. Endothelin B receptor (ETB)............................................................69
6 CONTENTS
6.2. Results..........................................................................................................70
6.2.1. Preparative cell-free expression of various GPCRs ......................... 70
6.2.2. Expression and purification of ETB and various ETB truncations.. 71
6.2.3. Functional analysis of full-length protein and ETB-truncations...... 76
6.2.3.1. Fluorescent ligand coelution.............................................76
6.