Genetic analysis of glycogen synthase kinase-3 in the adult mouse brain [Elektronische Ressource] / Patricia M. Steuber-Buchberger

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• Publié par: technische_universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 25
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

Lehrstuhl für Entwicklungsgenetik




Genetic analysis of Glycogen Synthase Kinase-3
in the adult mouse brain

Patricia M. Steuber-Buchberger

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur
Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. Grill
Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. W. Wurst
2. Univ.-Prof. A. Schnieke, Ph.D


Die Dissertation wurde am 11.06.2008 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 10.12.2008 angenommen. Danksagung
Danksagung
An erster Stelle gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. Wolfgang Wurst für die Aufnahme an
seinem Institut und die Möglichkeit meine Promotionsarbeit dort durchzuführen.
Sowohl sein Ideenreichtum als auch seine konstruktive Kritik und seine
Begeisterungsfähigkeit waren mir Motivation und haben meine Arbeit vorangetrieben.
Die gewährten Freiräume in der Gestaltung und Durchführung meiner
Forschungsarbeit förderten mein selbstständiges Denken und Handeln, sowie meine
Kreativität.
Meinem direkten Betreuer Herr Dr. Ralf Kühn möchte ich ganz besonders danken für
seine große Unterstützung, seine immer vorhandene Verfügbarkeit und seine
Motivationsfähigkeit. Mit seinem fundierten Wissen und seiner Bereitschaft für
zahlreiche Diskussionen schärfte er mein wissenschaftliches Denken und
Verständnis maßgeblich.
Mein Dank richtet sich besonders an Frau Prof. Dr. Schnieke und Herrn Prof. Dr. Grill
für ihre Bereitschaft meine Dissertation zu begutachten und die Promotionsprüfung
durchzuführen.
Frau Dr. Daniela Vogt Weisenhorn möchte ich danken für ihre wissenschaftliche
Unterstützung bei histologischen Fragen und für ihre Hilfe bei vielen Fragen anderer
Art. Als ständige Ansprechpartnerin bei Verhaltensfragen in Bezug auf Mäuse
verdient Frau Dr. Sabine Hölter-Koch ein besonderes Dankeschön. Auch meinen
Kooperationspartnern im GMC, insbesondere Dr. Helmut Fuchs, Dr. Valerie Gailus-
Durner, Dr. Anja Schrewe und Dr. Ilona Moßbrugger, danke ich für ihre
unbürokratische und wertvolle Hilfe bei der Analyse meiner Mauslinien. Mein
aufrichtiger Dank geht auch an unsere Tierpfleger in der DoBe und im C-Streifen für
ihre Mithilfe und Aufmerksamkeit bei der Betreuung meiner Mäuse.
Für technische und private Unterstützung sowie eine tolle Arbeitsatmosphäre danke
ich ganz besonders herzlich unseren technischen Assistentinnen Regina
Kneuttinger, Katrin Angermüller, Stefanie Greppmair, Adrianne Tasdemir, Susi
Weidemann und Annerose Kurz-Drexler. Dank ihrer tatkräftigen Hilfe und ihrem Rat
konnte ich viel erreichen. Auch meinen Kollegen, insbesondere Benedikt Wefers, gilt
mein Dank für die gute Zusammenarbeit und gegenseitige Hilfe im Labor, die vieles Danksagung
erleichtert und noch mehr ermöglicht hat. Allen Mitarbeitern im Institut danke ich für
ihre kollegiale Hilfsbereitschaft in vielen Fällen und die angenehme
Arbeitsatmosphäre.
Christiane, Anne, Cordula, Regina und Katie danke ich für ihre Freundschaft, ihre
Unterstützung und Verständnis, sowie ihr offenes Ohr für alle Lebenslagen. Ohne
Euch wäre diese Zeit nicht dieselbe gewesen!
Mein liebster Dank und Respekt gilt meinem Mann und meinen Eltern für ihre
unendliche Geduld, die zahllosen Gespräche und die grenzenlose Unterstützung
während des Studiums und der Promotionszeit. Ohne Euch hätte ich es nicht bis
hierher geschafft. Danke, dass ihr immer an meiner Seite seid!











Die Wissenschaft fängt eigentlich erst da an interessant zu werden, wo sie aufhört.
Justus von Liebig (1803-1873)
Content
1 SUMMARY 1
2 INTRODUCTION 3
2.1 GLYCOGEN SYNTHASE KINASE 3 – A MULTIFUNCTIONAL KEY REGULATOR 3
2.1.1 Regulation of GSK-3 3
2.1.2 The Gsk-3 knockout mice 7
2.1.3 Functions of GSK-3 in the regulatory network of the cell 8
2.1.4 Linkage of GSK-3 to human diseases 10
2.2 THE WORLD OF RNA INTERFERENCE 12
2.2.1 The RNAi pathway 12
2.2.2 Application of RNAi in mice 14
2.3 AIM OF THE THESIS 15
3 MATERIALS 17
3.1 INSTRUMENTS 17
3.2 CHEMICALS 18
3.3 CONSUMABLES AND OTHERS 21
3.4 COMMON AND STOCK SOLUTIONS 22
3.5 MOLECULAR BIOLOGY 23
3.5.1 Kits 23
3.5.2 Work with bacteria 23
3.5.2.1 E.coli strains 23
3.5.2.2 Solutions 24
3.5.3 Southern blot analysis 24
3.5.4 Northern blot analysis 25
3.5.4.1 Solutions 25
3.5.4.2 Oligonucleotide probes 25
3.5.5 Western blot analysis 25
3.5.5.1 Solutions 25
3.5.5.2 Antibodies 26
3.5.6 Enzymes 26
3.5.7 Vectors and plasmids 27
3.5.8 Oligonucleotides 27
3.5.8.1 Oligonucleotides for genotyping 27
3.5.8.2 leotides for PCR amplification 28
3.5.8.3 Oligonucleotides for sequencing 28
- iv -
3.5.8.4 Oligonucleotides for cloning 29
3.6 HISTOLOGICAL METHODS 30
3.6.1 Kits 30
3.6.2 Solutions for RNA in situ hybridization on paraffin sections 30
3.6.3 Solutions for DIG labeled in situ hybridization 30
3.6.4 Antibodies for histology 32
3.6.5 LacZ staining solutions 32
3.6.6 Staining solutions 32
3.7 EMBRYONIC STEM CELL CULTURE 33
3.7.1 ES cell lines 33
3.7.2 Culture medium 33
3.8 MOUSE STRAINS 34
3.8.1 Wild type and other used mouse strains 34
3.8.2 Generated mouse lines 34
4 METHODS 35
4.1 MOLECULAR BIOLOGY 35
4.1.1 Cloning and work with plasmid DNA 35
4.1.1.1 Production and transformation of competent bacteria 35
4.1.1.2 Preparation of plasmid DNA 36
4.1.1.3 Restriction digest of plasmid DNA 36
4.1.1.4 Isolation of DNA fragments 36
4.1.1.5 Ligation of DNA fragments 37
4.1.1.6 Sequencing 37
4.1.2 Analysis of genomic DNA 38
4.1.2.1 Isolation of genomic DNA 38
4.1.2.2 Southern Blot analysis 38
4.1.2.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) 39
4.1.3 Analysis of RNA 40
4.1.3.1 Sample preparation and isolation of RNA 40
4.1.3.2 Reverse transcription of mRNA into cDNA 41
4.1.3.3 Anchored PCR (5’ RACE) 41
4.1.3.4 Northern blot analysis 41
4.1.4 Analysis of protein samples 43
4.1.4.1 Preparation of protein samples 43
4.1.4.2 Western blot analysis 43
4.2 EMBRYONIC STEM CELL CULTURE 44
- v -
4.2.1 Preparation of mouse fibroblasts (feeder cells) 45
4.2.2 Expansion of ES cells 45
4.2.3 Storage and thawing of ES cells 46
4.2.4 Introduction of DNA into ES cells using FuGENE transfection 47
4.2.5 β-Gal reporter gene assay 47
4.2.6 Introduction of DNA into ES cells via electroporation 48
4.2.7 Isolation and screening of stably transfected ES cell clones 48
4.3 MOUSE HUSBANDRY 49
4.3.1 Housing 49
4.3.2 Generation of mice from ES cells 50
4.3.3 Establishment of new mouse lines 51
4.4 HISTOLOGY 51
4.4.1 Perfusion and dissection of adult mice 51
4.4.2 Preparation of paraffin sections 52
4.4.3 Preparation of frozen sections 53
4.4.4 Radioactive in situ hybridization on paraffin sections 53
4.4.5 DIG labeled in situ 55
4.4.6 Nissl staining (cresyl violet) 58
4.4.7 Immunhistochemistry (DAB-staining) 59
4.4.8 LacZ staining in mouse tissues 60
4.5 GERMAN MOUSE CLINIC 61
4.5.1 Behavioral testing 61
4.5.1.1 Modified Hole Board test 62
4.5.1.2 Light-dark box 63
4.5.1.3 Accelerating rotarod 63
4.5.1.4 Forced swim test 64
4.5.2 Cardiovascular analysis 64
4.5.3 Pathological analysis 65
5 RESULTS 67
5.1 EXPRESSION OF GSK-3 DURING DEVELOPMENT AND IN THE ADULT MOUSE BRAIN 67
5.1.1 Construction of ISH probes 67
5.1.2 Expression of Gsk-3 during embryonic development 68
5.1.3 Expression of Gsk-3 in the adult mouse brain 69
5.2 TARGETING OF THE GSK-3 Α LOCUS BY A GENE TRAP VECTOR 70
5.2.1 The gene trap strategy 70
5.2.2 Confirmation of the Gsk-3 α gene trap clone 71
- vi -
5.2.3 Generation of homozygous gene trap mice 72
5.2.4 Analysis of the Gsk-3 α gene trap mice 73
5.3 GENERATION OF CONDITIONAL KNOCKDOWN MICE BY RNA INTERFERENCE 74
5.3.1 Cloning of shRNA vectors 75
5.3.2 Cloning of conditional shRNA vectors 77
5.3.3 Cre mediated recombination of conditional shRNA vectors 78
5.3.4 Tests for knockdown efficiency of shRNAs 78
5.3.4.1 Real-time qRT-PCR of transfected ES cells 78
5.3.4.2 pScreeniT™ system of Invitrogen 79
5.3.4.3 Knockdown of GSK-3 in transfected ES cells 83
5.3.5 Simultaneous conditional knockdown of two genes in mice 85
5.3.6 Integration of shRNAs into ES cells by RMCE 86
5.3.7 Transfer of shRNAs into ES cells 89
5.3.8 Generation of conditional knockdown mice 90
5.4 CHARACTERIZATION OF USED