Genetics of scleroglucan production by Sclerotium rolfsii [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Jochen Schmid

Jochen Schmid

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• Publié par: technische_universitat_berlin
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 41
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

Genetics of scleroglucan production by
Sclerotium rolfsii





Vorgelegt von Dipl.-Ing.
Jochen Schmid
Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurswissenschaften
-Dr.-Ing.-


genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. rer.nat. Roland Lauster
Gutachter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl rof. Dr. Johannes Wöstemeyer

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 02.12.2008


Berlin 2008

D83










































Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von April 2005 bis März 2008 im Fachgebiet
Mikrobiologie und Genetik des Institutes für Biotechnologie der TU Berlin erstellt.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl für die Bereitstellung des Themas, seine
großzügige, unermüdliche Unterstützung und die stete Bereitschaft zu konstruktiven
Diskussionen.

Prof. Dr. Johannes Wöstemeyer danke ich sehr herzlich für die Übernahme des Gutachtens
dieser Arbeit.

Mein weiterer Dank gilt Frau Dr. habil. Vera Meyer, in deren Arbeitsgruppe diese Arbeit
angefertigt wurde. Sie stand mir als direkte Ansprechpartnerin auch aus der Ferne stets
hilfreich zur Seite und hat viel zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Vera ich wünsche
Dir alles Gute.

Bei Frau Laura Funk bedanke ich mich sehr herzlich für die tatkräftige Unterstützung, sowie
für ihr Interesse und Engagement in diese Arbeit und die stets gute Zeit im Labor.

Herrn Dr. Udo Schmidt, Frau Dr. Anja Spielvogel, Frau Dr. Cornelia Luban, Frau Eva Graf,
Herrn Sean Patrick Riechers, danke ich ganz herzlich für die viele anregende Diskussion,
nicht nur wissenschaftlicher Art. Bei Frau Birgit Baumann und Frau Susanne Engelhardt
bedanke ich mich für die äußerst gute und erheiternde Atmosphäre im Institut und die sehr
geselligen Mittagspausen.

Bei Herrn Thomas Bekel bedanke ich mich für die hilfreiche Unterstützung bei der
Sequenzanalyse und für die Bereitstellung des von ihm entwickelten SAMS Systems,
welches die Arbeit mit der Unmenge an Daten unglaublich erleichterte.

Für die finanzielle Unterstützung danke ich dem BMBF. Besonderer Dank gilt auch Herrn Dr.
Volker Sieber welcher als Projektleiter fungierte und stets mit sehr guten Ideen und
Hinweisen zum gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.

Des Weiteren bedanke ich mich ganz herzlich bei Dr. Dirk Müller-Hagen für seine
Unterstützung auch nach seinem Weggang, ohne Ihn wäre diese Arbeit nie so gelungen.
Ein weiteres Dankeschön auch an seine Frau Dr. Silke Müller-Hagen, für das sicherlich nicht
immer einfache Korrekturlesen der Arbeit.
Ganz besonderer Dank gilt auch Frau Rita Waggad, für Ihren unermüdlichen Einsatz in der
Bereitstellung von Dingen aller Art, ohne die manch ein Versuch nicht so schnell hätte
durchgeführt werden können und auch für die guten Gespräche in den Freiräumen. Danke
Rita.

Allen weiteren Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Fachgebietes Mikrobiologie danke ich
für die nette und kooperative Zusammenarbeit, insbesondere, Frau Roslin Bensmann (für die
Korrekturen des Englischen) und Frau Sonja Leberecht, welche sich immer großartig für
mich einsetzten.

Abschließender und überaus herzlicher Dank gebührt meinen Eltern, meiner Schwester Birgit
und vor allem meiner Freundin Anja für deren stete Unterstützung und das unendliche
Verständnis auch in schwierigen Zeiten. Danke!
Contents

List of Abbreviations _______________________________________________________________ I
Coding of Nucleotides and Amino Acids ______________________________________________ II
List of Figures __________________________________________________________________ III
List of Tables and supplemental data _______________________________________________ IV

I Introduction _____________________________________________________ - 1 -
II Fungal genomics: Advances in exploring sequence data ________________ - 2 -
III Post-genomic approaches to unravel the metabolism of filamentous fungi __ - 3 -
Transcriptomics _________________________________________________________ - 4 -
Proteomics _____________________________________________________________ - 5 -
Metabolomics __________________________________________________________ - 5 -
IV Metabolic engineering: Finding the optimum genetic strategy ____________ - 7 -
Choosing the right transformation technique __________________________________ - 7 -
V Enhancing gene targeting efficiency __________________________________ - 9 -
RNA-based tools for metabolic engineering- 10 -
VI Concluding remarks and prospects _________________________________ - 13 -
1 Scleroglucan: a versatile polysaccharide of biotechnological value _______ - 16 -
1.1 Structure and properties of scleroglucan _____________________________________ - 16 -
1.2 Industrial applications of scleroglucan ______________________________________ - 17 -
1.3 Brand names and producers of scleroglucan - 18 -
1.4 Biosynthesis of scleroglucan ______________________________________________ - 19 -
1.5 Structure and properties of oxalate _________________________________________ - 20 -
1.6 Microbial oxalate metabolism _____________________________________________ - 20 -
1.7 Conditions that favour scleroglucan and oxalate production by S. rolfsii ____________ - 22 -
2 Aim of the thesis ________________________________________________ - 24 -
3 Materials and Methods ___________________________________________ - 25 -
3.1 Equipment ____________________________________________________________ - 25 -
3.2 Enzymes, chemicals and kits - 25 -
3.3 Strains _______________________________________________________________ - 26 -
3.4 Plasmids _____________________________________________________________ - 26 -
3.5 Culture media _________________________________________________________ - 27 -
3.6 Buffers reagents and solutions ____________________________________________ - 28 -
3.7 Selection of putative S. rolfsii transformants _________________________________ - 29 -
3.8 Homogeneous S. rolfsii suspension_________________________________________ - 29 -
3.9 Cultivation conditions for bacteria and filamentous fungi _______________________ - 29 -
3.10 Cryoculture ___________________________________________________________ - 29 -
3.11 Methods for DNA and RNA analysis and modification _________________________ - 30 -
3.11.1 Quantification of RNA and DNA by UV-spectroscopy ____________________ - 30 -
3.11.2 Synthesis of cDNA library __________________________________________ - 30 -
3.11.3 Suppression Subtractive Hybridisation (SSH) ___________________________ - 30 -
3.11.4 Clonetch PCR-Select cDNA Subtraction Kit ____________________________ - 30 -
3.11.5 Reverse Northern Blotting for verification of SSH-clones __________________ - 30 -
3.12 Transformation methods _________________________________________________ - 31 -
3.12.1 Preparation of heat shock competent E. coli _____________________________ - 31 -
3.12.2 E. coli transformation protocol _______________________________________ - 31 -
3.13 Agrobacterium mediated transformation (AMT) ______________________________ - 31 -
3.13.1 Transformation of S. rolfsii using A. tumefaciens _________________________ - 31 -
3.13.2 Protoplast mediated Transformation (PMT) - 31 -
3.14 Analytics _____________________________________________________________ - 32 -
3.14.1 Quantitative analysis of mycelia and scleroglucan (Degussa method) _________ - 32 -
3.14.2 sis of oxalate ______________________________________ - 32 -
3.14.3 sis of glucose and fructose ____________________________ - 32 -
3.15 Methods for DNA and RNA analysis - 32 -
3.15.1 Isolation of plasmid DNA from E. coli _________________________________ - 32 -
3.15.2 Preparation of fungal genomic DNA for PCR approaches __________________ - 32 -
3.15.3 Isolation of genomic DNA from S. rolfsii _______________________________ - 33 -
3.15.4 DNA isolation from Hordeum vulgare - 33 -
3.15.5 Isolation of DNA fragments from agarose gel ___________________________ - 33 -
3.15.6 Purification of DNA _______________________________________________ - 33 -
3.15.7 Restriction _______________________________________________________ - 33 -
3.15.8 Ligation _________________________________________________________ - 34 -
3.15.9 Isolation of RNA from S. rolfsii using CsCl-pad _________________________ - 34 -
3.15.10 Gel electrophoreses ________________________________________________ - 34 -
3.15.11 Northern blot analysis ______________________________________________ - 34 -
3.15.12 Southern blot analysis - 34 -
3.16 PCR ____________________