Identification et caractérisation fonctionnelle de gènes régulateurs de la voie de biosynthèse des flavonoïdes chez la Vigne

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Sous la direction de Virginie Lauvergeat
Thèse soutenue le 12 novembre 2009: Bordeaux 1
Les composés phénoliques de la baie, et plus particulièrement les flavonoïdes (flavonols, tanins condensés, anthocyanes), constituent un des paramètres clés contrôlant la qualité organoleptique du raisin et du vin. Ils représentent également une source de molécules antioxydantes d’intérêt grandissant pour les industries pharmacologiques, agro-alimentaires et cosmétiques. De nombreux travaux réalisés sur les plantes modèles ont démontré que la régulation de la voie de biosynthèse des flavonoïdes est essentiellement gouvernée par des facteurs de transcription de type MYB, bHLH et des protéines de type WD40. Chez la Vigne (Vitis vinifera L.), plusieurs facteurs de transcription de type MYB régulant la voie des anthocyanes et/ou des tanins condensés ont déjà été identifiés. Cependant, aucun facteur de transcription de type bHLH ou WD40 n’a encore été caractérisé. Différentes approches ont été mises en œuvre pour identifier de nouveaux régulateurs de la voie des flavonoïdes chez la Vigne. Dans un premier temps, le facteur de transcription VvMYB5b a été utilisé comme appât dans une approche de double hybride non ciblé chez la Levure (Saccharomyces cerevisiae). Dans un deuxième temps, le promoteur d’un gène codant une enzyme centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes, VvDFR, a été choisi afin de développer une approche de simple hybride non ciblé chez la Levure. Enfin, une approche ciblée vers des « gènes candidats » a permis l’identification des facteurs de transcription de type bHLH VvMYC1 et VvMYCA1. Le profil d’expression de VvMYCA1 correspond à celui de l’accumulation des tanins condensés dans la pellicule, et celui de VvMYC1 corrèle avec le profil de synthèse des flavonols, des anthocyanes et des tanins condensés dans la baie de raisin, ainsi que dans les inflorescences. De plus, VvMYC1 peut interagir avec différents partenaires MYB de Vigne régulant la synthèse des anthocyanes et/ou des tanins condensés, à la fois dans la Levure mais également in planta, où l’interaction VvMYC1/VvMYBs affecte l’expression de gènes structuraux tels que l’UFGT et l’ANR. Cette interaction induit une synthèse d’anthocyanes, aussi bien en système homologue qu’en système hétérologue (Tabac et Arabidopsis). Enfin, des essais complémentaires impliquant le promoteur de VvMYC1 ont permis de démontrer que VvMYC1, en interagissant avec VvMYBPA1, peut moduler sa propre expression in vivo.
-Vigne
-facteurs de transcription
-flavonoïdes
-MYB
-régulation
-bHLH
-transcription
Phenolic compounds, and more specifically flavonoids (flavonols, condensed tannins and anthocyanins), are key components of the grapevine and wine quality. Because of their antioxidant activities, these compounds are of interest in pharmacological and cosmetic industries, as well as being beneficial to the human diet. Previous work on model plants showed that the flavonoid pathway was mainly regulated by the MYB and bHLH transcription factors, and WD40 proteins. In the grapevine (Vitis vinifera L.), only MYB regulators have been identified until now, and no bHLH or WD40 have been characterised. In this work, several approaches were used to identify new transcription factors involved in grapevine flavonoid biosynthesis. Firstly, the VvMYB5b protein was used as a bait in a large scale two hybrid experiment in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Secondly, the promoter of the VvDFR gene, coding a central enzyme of the flavonoid pathway, was chosen to conduct a large scale one hybrid experiment, also in yeast. Finally, a “gene candidate” approach allowed identification of the bHLH transcription factors VvMYC1 and VvMYCA1. VvMYCA1 expression profile in berry skin and seeds correlates with condensed tannins synthesis, whereas VvMYC1 transcript accumulation in these tissues and the grapevine inflorescence correlates with condensed tannins, anthocyanins and flavonols accumulation. In yeast, VvMYC1 could physically interact with different MYB partners regulating the anthocyanin or the condensed tannins biosynthesis. This interaction was confirmed by transient promoter assays in grape cell suspensions, where co-expression of VvMYC1 with specific MYB partners activated the UFGT and ANR promoters. Likewise, this interaction induced anthocyanin accumulation in grape cells, as well as in tobacco leaves and Arabidopsis. Eventually, additional transient promoter assays revealed that VvMYC1 is involved, with VvMYBPA1, in feedback regulation of its own expression.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13875/document

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THESE

PRESENTEE A

L’UNIVERSITE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

PAR

Imène Hichri

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR

SPECIALITE : BIOLOGIE VEGETALE




Identification et caractérisation fonctionnelle de gènes
régulateurs de la voie de biosynthèse des flavonoïdes chez
la Vigne



soutenue le 12 Novembre 2009




Devant le jury composé de :


Mme Jacqueline Grima-Pettenati Directrice de Recherches, CNRS TOULOUSE Rapporteur
M Philippe Hugueney Directeur de Recherches, INRA COLMAR Rapporteur

Mme Rossitza Atanassova Professeur, Univ. de POITIERS Examinatrice
Mme Stéphanie Cluzet Maître de Conférences, Univ. BORDEAUX 2 Examinatrice
M Serge Delrot Professeur, Univ. BORDEAUX 2 Examinateur
Mme Virginie Lauvergeat Maître de Conférences, Univ. BORDEAUX 1 Dir. de thèse


1
RESUME






Les composés phénoliques de la baie, et plus particulièrement les flavonoïdes (flavonols,
tanins condensés, anthocyanes), constituent un des paramètres clés contrôlant la qualité
organoleptique du raisin et du vin. Ils représentent également une source de molécules
antioxydantes d’intérêt grandissant pour les industries pharmacologiques, agro-alimentaires et
cosmétiques. De nombreux travaux réalisés sur les plantes modèles ont démontré que la
régulation de la voie de biosynthèse des flavonoïdes est essentiellement gouvernée par des
facteurs de transcription de type MYB, bHLH et des protéines de type WD40. Chez la Vigne
(Vitis vinifera L.), plusieurs facteurs de transcription de type MYB régulant la voie des
anthocyanes et/ou des tanins condensés ont déjà été identifiés. Cependant, aucun facteur de
transcription de type bHLH ou WD40 n’a encore été caractérisé.
Différentes approches ont été mises en œuvre pour identifier de nouveaux régulateurs de la
voie des flavonoïdes chez la Vigne. Dans un premier temps, le facteur de transcription
VvMYB5b a été utilisé comme appât dans une approche de double hybride non ciblé chez la
Levure (Saccharomyces cerevisiae). Dans un deuxième temps, le promoteur d’un gène codant
une enzyme centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes, VvDFR, a été choisi afin de
développer une approche de simple hybride non ciblé chez la Levure.
Enfin, une approche ciblée vers des « gènes candidats » a permis l’identification des
facteurs de transcription de type bHLH VvMYC1 et VvMYCA1. Le profil d’expression de
VvMYCA1 correspond à celui de l’accumulation des tanins condensés dans la pellicule, et
celui de VvMYC1 corrèle avec le profil de synthèse des flavonols, des anthocyanes et des
tanins condensés dans la baie de raisin, ainsi que dans les inflorescences. De plus, VvMYC1
peut interagir avec différents partenaires MYB de Vigne régulant la synthèse des anthocyanes
et/ou des tanins condensés, à la fois dans la Levure mais également in planta, où l’interaction
VvMYC1/VvMYBs affecte l’expression de gènes structuraux tels que l’UFGT et l’ANR.
Cette interaction induit une synthèse d’anthocyanes, aussi bien en système homologue qu’en
système hétérologue (Tabac et Arabidopsis). Enfin, des essais complémentaires impliquant le
promoteur de VvMYC1 ont permis de démontrer que VvMYC1, en interagissant avec
VvMYBPA1, peut moduler sa propre expression in vivo.

Mots clés : Vigne-flavonoïdes-régulation-transcription-facteurs de transcription-MYB- bHLH









2
ABSTRACT




Phenolic compounds, and more specifically flavonoids (flavonols, condensed tannins and
anthocyanins), are key components of the grapevine and wine quality. Because of their
antioxidant activities, these compounds are of interest in pharmacological and cosmetic
industries, as well as being beneficial to the human diet. Previous work on model plants
showed that the flavonoid pathway was mainly regulated by the MYB and bHLH
transcription factors, and WD40 proteins. In the grapevine (Vitis vinifera L.), only MYB
regulators have been identified until now, and no bHLH or WD40 have been characterised.
In this work, several approaches were used to identify new transcription factors involved in
grapevine flavonoid biosynthesis. Firstly, the VvMYB5b protein was used as a bait in a large
scale two hybrid experiment in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Secondly, the promoter of
the VvDFR gene, coding a central enzyme of the flavonoid pathway, was chosen to conduct a
large scale one hybrid experiment, also in yeast.
Finally, a “gene candidate” approach allowed identification of the bHLH transcription
factors VvMYC1 and VvMYCA1. VvMYCA1 expression profile in berry skin and seeds
correlates with condensed tannins synthesis, whereas VvMYC1 transcript accumulation in
these tissues and the grapevine inflorescence correlates with condensed tannins, anthocyanins
and flavonols accumulation. In yeast, VvMYC1 could physically interact with different MYB
partners regulating the anthocyanin or the condensed tannins biosynthesis. This interaction
was confirmed by transient promoter assays in grape cell suspensions, where co-expression of
VvMYC1 with specific MYB partners activated the UFGT and ANR promoters. Likewise, this
interaction induced anthocyanin accumulation in grape cells, as well as in tobacco leaves and
Arabidopsis. Eventually, additional transient promoter assays revealed that VvMYC1 is
involved, with VvMYBPA1, in feedback regulation of its own expression.

Key words: Grapevine-flavonoids- regulation-transcription-transcription factors-MYB-bHLH

















3
ABREVIATIONS


3’UTR 3’ Untranslated Region (région non traduite en 3’)
5’UTR 5’ Untranslated Region (région non traduite en 5’)
aa acide aminé
ABA Acide Abscissique
ADN Acide Désoxyribonucléique
ADNc Acide Désoxyribonucléique complémentaire
ADN-T Acide Désoxyribonucléique de Transfert
ANA Acide Naphtalène Acétique
ARN Acide Ribonucléique (m: messager, r: ribosomal)
ARN pol II ARN polymérase II
ARS Séquence de Réplication Autonome
BAP 6-Benzylaminopurine
BET Bromure d’Ethidium
CTAB Bromure d’hexadécyltriméthylammonium
dA/T/C/GTP désoxyAdénos/Thymid/Cytos/Guanos/ine 5’Triphosphate
DAPI 4’6’ Di Amidino-2-Phényl Indole
DEPC Diéthyl Pyrocarbonate
DMSO Diméthylsulfoxyde
dNTP désoxynucléoside 5’Triphosphate
DPBA Diphénylboric Acid 2-aminoéthyl ester
DTT Dithiothréitol
EBG Early Biosynthetic Genes (gènes de biosynthèse précoces)
EMS Ethyl Méthyl Sulfonate
EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay
EST Expressed Sequence Tag
FT Facteur de Transcription
GTF General Transcription Factor
IAA Alcool Isoamylique
IPTG Isopentényl-β-D-thiogalactopyranoside
EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique
HPLC Chromatographie Liquide à Haute Performance
LB « Left Border » (bordure gauche d’un ADN-T)
LB Luria Bertani
LBG Late Biosynthetic Genes (gènes de biosynthèse tardifs)
MES Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique
MS Murashige et Skoog
NaAc Acétate de sodium
NASC Nottingham Arabidopsis Stock Center
NLS Nuclear Localization Signal (signal de localisation nucléaire)
NOS Nopaline Synthase
NptII Néomycine Phosphotransférase II
ON Over Night (~ 16h)
ONPG O-Nitrophényl β-D-Galactopyranoside
ORF Open Reading Frame (cadre de lecture ouverte)
PAs Proanthocyanidines
PCR Polymerase Chain Reaction (réaction de polymérisation en chaîne)
PEG Polyéthylène Glycol
Pfu Pyrococcus furiosus
PB Pinot Blanc
PG Pinot Gris
PIC Preinitiation Complex (complexe de pré-initiation)
4
PMSF Phénylméthylsulphonyl Fluoride
PN Pinot Noir
PVPP Polyvinylpolypyrrolidone
RB « Right Border » (bordure droite d’un ADN-T)
RE Réticulum Endoplasmique
RNase Ribonucléase
RNasin Ribonuclease Inhibitor
RT Reverse Transcription
SD Synthetic Dropout
SDS Dodécylsulfate de Sodium
Taq Thermophilus aquaticus
TBP TATA box Binding Protein
TC Tentative Consensus
TE Tris-EDTA
Tm Melting Temperature
UV Ultraviolet
WT Wild-Type (type sauvage)
X-Gal 5-bromo 4-chloro 3-indole 1-D-galactopyranoside
X-α-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-α-D-Galactopyranoside


Unité et facteurs de multiplication
-12
°C degré Celsius p pico (10 )
-6
μ micro (10 ) Pa Pascal
Da Dalton pb paire de base
DO Densité Optique p/v poids/volume
g gramme pH potentiel Hydrogène
h heure SAF Semaines Après Floraison
j jour s seconde
k kilo U Unité enzymatique
L Litre v/v volume/volume
-3
m milli (10 )
M Molaire (mole/Litre)
min minute
-9
n nano (10 )


Gènes et protéines


AD Activation Domain F3’5’H Flavonoide 3’,5’-Hydroxylase
ANR Anthocyanidine Réductase FLS Flavonol Synthase
ANS Anthocyanidine Synthase GFP Green Fluorescent Protein
bHLH basic Helix-Loop-Helix GUS β-glucuronidase
C4H Cinnamate-4-Hydroxylase LAR Leucoanthocyanidine Réductase
CHI Chalcone Isomérase LDOX Leucoanthocyanidine Dioxygénase
CHS Chalcone Synthase MYB Myeloblastosis
4CL 4-Coumaroyl:CoA-Ligase OMT O-Méthyltransférase
DBD DNA Binding Domain PAL Phénylalanine Ammonialyase
DFR Dihydroflavonol 4-Réductase STS Stilbène Synthase
F3H Flavanone 3-Hydroxylase UFGT UDP-glucose: Flavonoid Glycosyl Transférase
F3’H Flavonoide 3’-Hydroxylase

5
Liste des Figures

INTRODUCTION

Figure 1. Structure détaillée d’une jeune baie de raisin et d’un pépin
Figure 2. Accumulation différentielle d’anthocyanes dans la pellicule de cultivars de Vigne
Vitis vinifera L.
Figure 3. Le développement de la baie de raisin
Figure 4. Accumulation des brassinostéroïdes au cours du développement de la baie
Figure 5. Les composés phénoliques chez les plantes
Figure 6. Les acides phénoliques chez les plantes
Figure 7. Structure chimique des monolignols
Figure 8. Structure chimique des stilbènes
Figure 9. Structure moléculaire de base des flavonoïdes
Figure 10. Structure chimique des flavonols de la Vigne
Figure 11. Structure des polymères de proanthocyanidines
Figure 12. Formation des pépins et accumulation des tanins au cours du développement de la
baie de raisin
Figure 13. Le cation flavylium
Figure 14. Biosynthèse du resvératrol et de la chalcone à partir de la phénylalanine
Figure 15. Analyse par RNA blot de l’abondance des transcrits des gènes codant les enzymes
de biosynthèse des anthocyanes dans la pellicule des baies de raisin
Figure 16. La synthèse des principales classes de flavonoïdes chez la Vigne
Figure 17. Organisation des métabolons de la voie des composés phénoliques
Figure 18. Modèles des mécanismes de transport des flavonoïdes du réticulum
endoplasmique jusqu’à la vacuole
Figure 19. Analyse par RT-PCR quantitative de l’accumulation des ARNm correspondant
aux gènes structuraux et régulateurs de la voie des anthocyanes dans la pellicule de baies
ombragées
Figure 20. Modification de la concentration en anthocyanes dans les pellicules de baies de
raisin Vitis vinifera L. (cv Cabernet Sauvignon) cultivées sous une température diurne
contrôle (25°C) ou plus élevée (35°C)
Figure 21. Structure du complexe de pré-initiation de la transcription
Figure 22. Représentation schématique des domaines fonctionnels d’un facteur de
transcription de plante
Figure 23. Les différentes étapes de la régulation de la transcription par un facteur de
transcription de type « activateur »
Figure 24. Représentation schématique des domaines fonctionnels des trois types de protéines
MYB: cMYB, Zea mays MYB C1, et Solanum tuberosum MYB1
Figure 25. Le locus MYBA chez le cépage Cabernet Sauvignon
Figure 26. Diversité de la structure des protéines HLH animales
Figure 27. Représentation schématique des domaines fonctionnels d’une protéine bHLH de
type R
Figure 28. Structure de la protéine WD40 Gβ
Figure 29. Modèle d’interaction du complexe régulateur MYB/bHLH/WD40:
TT2/TT8/TTG1

RESULTATS ET DISCUSSION

Figure 30. Principe du double hybride.
6
Figure 31. VvMY5b active la transcription de tous les gènes rapporteurs de la levure.
Figure 32. Propriétés trans-activatrices des différentes délétions C-terminales de VvMYB5b
Figure 33. Analyse par transformation transitoire de l’effet des délétions C-terminales de
VvMYB5b sur les propriétés trans-régulatrices de la protéine in planta

Figure 34. Alignement des séquences protéiques de VvMyb5bWT et VvMYB5bMut avec les
séquences protéiques de VvMYB5a, VvMYBPA1 et VvMYBA1
Figure 35. Effet de la mutation R69L de VvMYB5b sur la capacité d’activation du gène
rapporteur LacZ chez la levure
Figure 36. Analyse de l’effet de la mutation R69L sur les propriétés trans-régulatrices de
VvMYB5b in planta
Figure 37. Analyse de l’effet de la mutation R69L sur les propriétés d’hétérodimérisation de
VvMYB5b avec la protéine bHLH VvMYC1 chez la levure: mesure de l’activité β-
galactosidase
Figure 38. Principe de la technique du simple hybride
Figure 39. Séquence partielle du promoteur de la DFR utilisée pour l’expérience de simple
hybride
Figure 40. Test de simple hybride ciblé chez la levure S. cerevisiae
Figure 41. Effets de la sur-expression de VvMyb5bWT et VvMYB5bMut chez le Tabac
Figure 42. Analyse par RT-PCR quantitative de l’expression de la CHS, la F3H, la DFR,
ainsi que des transgènes chez trois tabacs sur-exprimant VvMYB5bWT et VvMYB5bMut


Figure 43. Amplification par PCR des fragments d’ADNc présents dans les levures co-
transformées par pGADT7-Rec/banque d’ADNc et pHIS2-DFR, sélectionnées sur milieu SD-
His-Leu-Trp + 60 mM3-AT
Figure 44. Séquence protéique de la flavanone 3-hydroxylase (F3H)
Figure 45. Localisation sub-cellulaire de la GFP-F3H, de la GFP-F3Hdél et de la GFP dans
des cellules d’épiderme d’oignon
Figure 46. Localisation sub-cellulaire des flavonoïdes dans des suspensions cellulaires de
vigne (V. vinifera cv Cabernet Sauvignon) par observation en microscopie confocale
Figure 47. Exemple de deux voies reliant l’état métabolique d’une cellule et la transcription
des gènes


Figure 48. Principe du clonage des séquences 5’ et 3’ des ADNc codant les protéines bHLH à
partir d’une banque d’ADNc
Figure 49. Séquence nucléotidique et protéique de VvMYC1
Figure 50. Le potentiel de phosphorylation de VvMYC1 et de bHLH4
Figure 51. Analyse phylogénétique de protéines bHLH régulant la voie des flavonoïdes chez
différentes espèces végétales
Figure 52. Localisation subcellulaire des différentes protéines bHLH de Vigne
Figure 53. Essai de trans-activation du gène rapporteur LacZ par les quatre protéines bHLH
d’intérêt chez la levure
Figure 54. Analyse de la capacité de liaison de bHLH4 aux promoteurs DFR et DFRmut par
simple hybride
Figure 55. Suivi de l’expression des quatre bHLH au cours du développement de la baie de
raisin (V. vinifera cv Cabernet Sauvignon) par RT-PCR quantitative
Figure 56. Expression relative des quatre bHLH dans la pellicule et les pépins au cours du
développement de la baie de raisin (V. vinifera cv Cabernet Sauvignon).
7
Figure 57. Analyse de l’expression des bHLH dans les organes végétatifs de Vigne (cv
Cabernet Sauvignon) par RT-PCR semi-quantitative
Figure 58. Analyse de l’expression des bHLH dans la pellicule de baies matures du mutant
naturel de V. vinifera cv Bequignol par RT-PCR semi-quantitative
Figure 59. Analyse par RT-PCR semi-quantitative de l’expression des différents facteurs
bHLH et MYBs dans la pellicule de baies matures de V. vinifera cv Pinot Noir (PN), Pinot
Gris (PG) et Pinot Blanc (PB)
Figure 60. Analyse de la capacité d’interaction de VvMYC1 ou VvMYC1ΔNterm (acides
aminés 219 à 701) avec lui-même et avec différentes partenaires MYB de Vigne par double
hybride chez la levure
Figure 61. Effet d’une délétion N-terminale (VvMYC1ΔNterm, acides aminés 219 à 701) et
d’une délétion C-terminale (VvMYC1ΔCterm, acides aminés 1 à 423) sur les propriétés de
trans-activation de VvMYC1.
Figure 62. Accumulation d’anthocyanes dans des cellules de limbe de feuilles de tabacs après
agro-infiltration
Figure 63. La sur-expression stable de VvMYC1 chez Arabidopsis, écotype En-2
Figure 64. Les profils d’expression spatio-temporelle de VvMYBPA1, VvMYB5b, VvMYBPA2
et VvMYBA (VvMYBA1, VvMYBA2 et VvMYBA3) au cours du développement de la baie de
raisin

MATERIEL ET METHODES

Figure 65. Principe de la technique Gateway
Figure 66. Exemple de courbes de fusion du gène EF1γ
Figure 67. Courbe d'efficacité de la PCR pour les amorces du gène Actine
Figure 68. Principe de la construction d’une banque d’ADNc utilisant la technique SMART
Figure 69. La recombinaison homologue de la banque d’ADNc dans pGADT7 ou pGADT7-
Rec2 chez la levure

ANNEXE2

Figure 70. Séquence de l’ADNc de VvMYCA1
Figure 71. Séquence de l’ADNc de bHLH3
Figure 72. Séquence de l’ADNc de bHLH4
Figure 73. Le potentiel de phosphorylation de VvMYCA1 et de bHLH3
Figure 74. Alignement de VvMYC1 et de ses plus proches homologues
Figure 75. Alignement de VvMYCA1 et de ses plus proches homologues
Figure 76. Alignement de VvMYC1, VvMYCA1 et de leurs plus proches homologues
Figure 77. Alignement des séquences protéiques de VvbHLH3 et de ses plus proches
homologues
Figure 78. Alignement des séquences protéiques de VvbHLH4 et de ses plus proches
homologues








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Liste des Tableaux


INTRODUCTION

Tableau 1. Exemples d’anthocyanidines
Tableau 2. Exemples de régulateurs MYB intervenant dans la synthèse des flavonoïdes chez
différentes espèces
Tableau 3. Exemples de facteurs de transcription de type MYB intervenant dans la synthèse
des flavonoïdes chez Vitis vinifera
Tableau 4. Caractéristiques de liaison à l’ADN des protéines bHLH de Riz et d’Arabidopsis
Tableau 5. Exemples de facteurs de transcription de type bHLH intervenant dans la synthèse
des flavonoïdes chez différentes espèces
Tableau 6. Les principaux facteurs de transcription MYB et bHLH impliqués dans des voies
de biosynthèse dépendantes de TTG1 chez Arabidopsis

RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau 7. Analyse des séquences protéiques déduites des séquences d’ADNc intégrées par
les clones de levures obtenus à l’issue du simple hybride


Tableau 8. Propriétés physico-chimiques des quatre protéines bHLH étudiées
Tableau 9. Test d'efficacité sur les différentes paires d'amorces utilisées pour l’analyse de
l’expression des gènes bHLH par RT-PCR qualitative
Tableau 10. Calcul de la stabilité et des facteurs de normalisation à partir des expressions
relatives des gènes de référence dans la baie entière au cours du développement de la baie

MATERIEL ET METHODES

Tableau 11. Composition du milieu de culture des suspensions cellulaires de vigne Vitis
vinifera cv Cabernet Sauvignon
Tableau 12. Composition du milieu Mac Cown gélosé où sont maintenues les plantules de
Vigne cultivées in vitro
Tableau 13. Composition du milieu de culture du Tabac et d’Arabidopsis
Tableau 14. Mélange réactionnel pour une PCR réalisée avec la Taq polymérase
Tableau 15. Composition du tampon d’extraction des ARN
Tableau 16. Traitement à la DNase des ARN
Tableau 17. Réaction de transformation de la souche de levure Y187
Tableau 18. Réaction de transformation de la souche de levure AH109
Tableau 19. Composition du tampon STET utilisé pour l’extraction d’ADN plasmidique de
levure
Tableau 20. Composition du tampon Z utilisé pour les essais β-galactosidase
Tableau 21. Composition du milieu W5. Ce milieu peut être stérilisé par autoclavage
Tableau 22. Composition du milieu MMM. Ce milieu doit être stérilisé par filtration
Tableau 23. Composition du milieu d’agro-infiltration des feuilles de tabac




9
ANNEXE5

Tableau 24. Amorces utilisées pour le suivi de l’expression du trangène VvMYB5b et des
gènes structuraux de la voie des flavonoides par RT-PCR quantitative dans les tabacs
transgéniques
Tableau 25. Les amorces utilisées pour les clonages relatifs à la DFR (simple hybride)
Tableau 26. Les amorces permettant d’amplifier les clones redondants
Tableau 27. Clonage des séquences 5’ et 3’ des ADNc correspondant aux quatre bHLH
Tableau 28. Les amorces utilisées pour l’analyse par RT-PCR quantitative en temps réel de
l’expression des bHLH
Tableau 29. Les amorces utilisées pour l’analyse par RT-PCR semi-quantitative de
l’expression des MYB dans le Pinot
Tableau 30. Les amorces universelles et les amorces situées sur les vecteurs de clonage





































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