Indentification of Avian pathogenic E. coli (APEC) genes important for the colonization of the chicken lung and characterization of the novel ExPEC adhesin I [Elektronische Ressource] / von Esther-Maria Antão geb. Bragança

Antao-Esther-Maria

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• Publié le: 01 janvier 2010
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Extrait

Identification of Avian pathogenic E. coli
(APEC) genes important for the colonization of
the chicken lung and characterization of the
novel ExPEC adhesin I
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Esther-Maria Antão geb. Bragança
(M. Sc. Microbiology)
geboren am 27.04.1982 in Berlin
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter: 1. Univ.-Prof. Dr. Richard Lucius
2. Univ.-Prof. Dr. Lothar H. Wieler
3. Univ.-Prof. Dr. Dr. Ulf B. Göbel

Tag der mündlichen Prüfung: 08.02.2010 Summary
Summary
The extraintestinal pathogen, avian pathogenic E. coli (APEC), known to cause systemic
infections in chickens, is responsible for large economic losses in the poultry industry
worldwide. In order to identify genes, involved in the early essential stages of pathogenesis,
namely adhesion and colonization, a lung colonization model of infection was established in
5-week old White leghorn specific-pathogen free (SPF) chickens, and Signature-tagged
mutagenesis (STM) was applied to this model by generating and screening a total of 1,800
mutants of an APEC strain IMT5155 (O2:K1:H5; Sequence type complex 95).
The study led to the identification of new genes of interest, including adhesins, genes
involved in capsule and LPS formation, regulators, transporters, metabolic enzymes and
genes of putative function. Among the many genes identified was one coding for a novel
APEC fimbrial adhesin (Yqi) not described for its role in APEC pathogenesis to date. Its gene
product was temporarily designated ExPEC Adhesin I (EA/I). Deletion of the ExPEC adhesin
I gene resulted in reduced colonization ability by APEC strain IMT5155 both in vitro and in
vivo. Furthermore, complementation of the adhesin gene restored its ability to colonize
epithelial cells in vitro. The ExPEC adhesin I protein was expressed as a fusion protein in
E. coli BL21 in vitro during the log phase as shown by SDS-PAGE and western blotting, to
reveal a protein with a molecular mass of ~ 39 kDa. Electron microscopy of an afimbriate
strain E. coli AAEC189 over-expressed with the putative EA/I gene cluster revealed short
fimbrial like appendages protruding out of the bacterial outer membrane.
We observed that this adhesin coding gene yqi is prevalent among extraintestinal pathogenic
E. coli (ExPEC) isolates, including APEC (54.4%), uropathogenic E. coli (UPEC) (65.9%) and
newborn meningitic E. coli (NMEC) (60.0%), and absent in all of the intestinal pathogenic
E. coli strains tested, thereby validating the designation of the adhesin as ExPEC Adhesin I.
In addition, prevalence of EA/I was most frequently associated with the E. coli phylogenetic
group B2 and ST95 complex of the multi locus sequence typing (MLST) scheme, with
evidence of a positive selection within this highly pathogenic complex.
This is the first report of the newly identified and functionally characterized ExPEC adhesin I
and its role during APEC infection in chickens.
iSummary
Keywords:
Avian pathogenic E. coli (APEC), Signature-tagged mutagenesis (STM), Chicken lung
infection model, ExPEC adhesin I (EA/I)
iiZusammenfassung
Zusammenfassung
Aviäre pathogene E. coli (APEC) sind extraintestinale Pathogene, die beim Huhn
systemische Infektionskrankheiten hervorrufen. APEC sind verantwortlich für erhebliche
wirtschaftliche Verluste in der Geflügelindustrie. Zur Identifizierung bakterieller Gene, die an
der Adhäsion und Kolonisierung des Wirtes beteiligt sind, wurde zunächst ein Lungen-
Infektionsmodell in fünf Wochen alten spezifisch Pathogen-freien (SPF) Hühnern etabliert. In
diesem Modell wurden 1.800 mittels Signature-tagged-Mutagenese (STM) hergestellten
Mutanten des APEC Prototypstamms IMT5155 (O2:K1:H5; Sequenztyp-Komplex 95) auf ihre
Fähigkeit zur Adhäsion und Kolonisierung im natürlichen Wirt getestet.
Die funktionelle Untersuchung führte zur Identifizierung bakterieller Gene, einschließlich
Adhäsin-, LPS- und Kapsel-bildenden Genen, Regulator-, Transport- und Stoffwechsel-
enzym-Genen, sowie Genen mit putativer Funktion. Die STM-Analyse erlaubte zudem die
Identifizierung eines zuvor nicht charakterisierten putativen Fimbrien-bildenden Adhäsins
(Yqi). Das Genprodukt wurde vorläufig als ExPEC Adhäsin I (EA/I) bezeichnet. Eine Deletion
des EA/I-Gens führte zu einer Reduzierung der Adhäsionsfähigkeit des Wildtyp-Stammes
IMT5155 sowohl in vitro in Zellkulturen als auch in vivo im Huhn. Eine Komplementierung
des EA/I-Gens in trans resultierte in einer partiellen Wiederherstellung des Adhäsions-
vermögens des Mikroorganismus an Epithel-Zellen in vitro. Das EA/I-Protein mit einer Größe
von ~39 kDa wurde als Fusionsprotein in dem E. coli- Stamm BL21 in vitro exprimiert, und
mittels SDS-PAGE und Western Blot nachgewiesen. Durch Überexpression des putativen
EA/I-Operons in dem Fimbrien-negativen E. coli-Stamm AAEC189 konnten schließlich mittels
elektronenmikroskopischer Aufnahmen Fimbrien-bildende Strukturen auf der äußeren
Membran des Mikroorganismus dargestellt werden.
Das Vorkommen des yqi in den untersuchten extraintestinal pathogenen E. coli (ExPEC),
einschließlich APEC (54.5%), uropathogenen E. coli (UPEC) (65.9%) und Neugeborenen-
Meningitis-verursachenden E. coli (NMEC) (60.0%), bei gleichzeitigem Fehlen in allen
untersuchten intestinal pathogenen E. coli bestätigt die Bezeichnung ExPEC Adhäsin I. Die
Prävalenz des EA/I-Gens war am stärksten assoziiert mit Stämmen der B2-Phylogenetische-
Gruppe sowie insbesondere mit Stämmen aus dem ST95-Komplex des Multi-Lokus-
Sequenz-Typisierungs (MLST)-Schemas. DNA-Sequenzanalysen ergaben zudem erste
Hinweise auf eine positive Selektion des EA/I-Gens innerhalb dieses ST95-Komplexes.
In der vorliegenden Promotionsarbeit gelang somit die Identifizierung und funktionelle
Charakterisierung des neuen ExPEC Adhäsin I, welches bei der APEC-Pathogenese im
natürlichen Wirt Huhn eine Rolle spielt.
iiiZusammenfassung
Schlagworte:
Aviäre pathogene E. coli (APEC), Signature-tagged Mutagenese (STM), Lungen-
Infektionsmodell, ExPEC Adhäsin I (EA/I)
ivAcknowledgement
Acknowledgement
Above all, I wish to thank God for His abundant Blessings and Graces throughout my life and
during my doctoral work.
The work presented was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)
research training group (Graduiertenkolleg 1121).
I would like to express my sincere thanks to Prof. Lothar Wieler for his invaluable help,
support and guidance during this work, and for his constant encouragement and motivation
for which I am grateful.
I’d also like to thank Christa in a special way for her supervision and support right from the
beginning, and for her vital inputs that have been of great help. Thanks to Ganwu for his
supervision during the early stages of my work.
My special thanks to Prof. Richard Lucius, Humboldt Universität zu Berlin and Prof. Ulf Göbel
for their external supervision during my doctoral studies.
I would like to thank all my friends and colleagues at the Institute for their help and for all the
good times.
Special thanks to Dr. Wilfried Bleiß from the Institute of Biology, Department of Molecular
Parasitology, Humboldt Universität zu Berlin, for his indispendable help with the electron
microscopy photographs, despite his busy schedule. Thanks to Dr. Alexander Karlas and
Prof. Thomas Meyer, Department of Molecular Biology, Max Planck Institute of Infection
Biology, and Dr. Ulrich Dobrindt, University of Würzburg, for providing me with the MDCK-1
cell line and afimbriate AAEC189 strain respectively. Thanks to Prof. Bernd Kaspers, Ludwig-
Maximilians-Universität, München, and Prof. Rudolf Preisinger for providing the chicken
fibroblast cell line and chickens for the animal experiments respectively. My thanks also goes
out to Prof. Karin Schnetz, Universität zu Köln, for providing the pKESK-22 expression
vector.
†I’d also like to remember the late Ursula Kahl , Bruno Kahl, and their daughters Luisa and
Antonia in a special way – I thank them for their help, generosity and friendship.
I thank my parents and sisters for all they have done for me, and Marylka for her kind heart.
For his love, encouragement, patience and goodness, I thank Melroy with all my heart......
God bless you all…
vAcknowledgement

viTable of Contents
Table of Contents
Summary ................................................................................................................................................. i
Zusammenfassung............................................................................................................................... iii
Acknowledgement................. v
Table of Contents