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Publié par | Thesee |
Nombre de lectures | 148 |
Langue | Français |
Poids de l'ouvrage | 32 Mo |
Extrait
UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11
FACULTÉ DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY
ECOLE DOCTORALE :
INNOVATION THÉRAPEUTIQUE : DU FONDAMENTAL A L’APPLIQUÉ
PÔLE : INGENIERIE DES PROTEINES ET CIBLES THERAPEUTIQUES
ANNÉE 2010 - 2011 SÉRIE DOCTORAT N°
THÈSE
Présentée
À L’UNITÉ DE FORMATION ET DE RECHERCHE
FACULTE DE PHARMACIE DE CHATENAY-MALABRY
UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11
pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11
par
Emeric GUENEAU
Titre de la thèse :
INTERACTIONS DE LA REGION C-TERMINALE DE
MLH1 NECESSAIRES A LA VOIE DE REPARATION
DES MESAPPARIEMENTS DE L'ADN
Soutenuele18mars2011
JURY: Prof.HermanVANTILBEURGH Président
Dr.IvanMATIC Rapporteur
Dr.MarcDELARUE Rapporteur
Dr.Sophie QUEVILLON/CHERUEL Examinateur
M.EtienneROULEAU Examinateur
Dr.Jean/BaptisteCHARBONNIER Directeurdethèse
tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011
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tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011Avant-propos
Cettethèse,financéeparleMinistèredel’EnseignementSupérieuretdelaRecherche
etlaFondationpourlaRechercheMédicale,s’estdérouléeauLaboratoiredeBiologie
Structurale et Radiobiologie au sein de l'iBiTec/S du CEA/Saclay. Je remercie
BernardGILQUIN,directeurdulaboratoire,pourm’avoiraccueilliaucoursdeces
troisannéesetdemie.
LadirectiondecetravailaétéassuréeparJean/BaptisteCHARBONNIER,quim’a
encadréetconseilléauquotidien.Sadisponibilité,sondynamismeetsabienveillance
m’ont permis de surmonter les difficultés rencontrées au cours de cette thèse. Par
ailleurs,parsarigueuretsonespritcritique,ilasuapporteràcetravaillerecul
nécessaire.Pourtoutcela,jeluisuistrèsreconnaissant.
JetiensàremercierHermanVANTILBEURGHpouravoiracceptédeprésiderle
jurydemasoutenancedethèse.J’exprimemagratitudeàMarcDELARUE etIvan
MATIC qui ont accepté de juger ce travail en tant que rapporteurs, ainsi qu’à
Sophie QUEVILLON/CHERUEL et Etienne ROULEAU qui ont accepté de faire
partiedujury.Jelesremercietouspourletempsqu’ilsontconsacréàlalectureetà
lacritiquedecemanuscrit.
Parailleurs,cettethèseestloind’êtrelerésultatd’untravailisolé,jesouhaiterais
doncremerciertouteslespersonnesayantcontribuéàsonaboutissement.
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Floriana LONDINO et Pierre
BONNESOEURquim'ontépaulétoutaulongdemathèse.Sanseux,unegrande
partie des résultats n'aurait pas vu le jour. Je remercie également le programme
"PlasticitéetInstabilitéduGénome"duCEAquilesafinancés.
Je remercie également Marcela NUNEZ et Carine TELLIER/LEBEGUE pour leur
participationaudémarrageduprojet.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Marie/Hélène LE DU pour son aide en
cristallographie ainsi que Sophie ZINN/JUSTIN pour sa contribution dans la
modélisation.
Je suis également très reconnaissant envers les personnes avec lesquelles j’ai eu le
plaisirdecollaborer.
JeremercieSergeBOITEUXetClaudineDHERINpourleurimmensecontribution
au projet, aussi bien pour les expériences de génétiques que pour leurs nombreux
conseilsetidées.
tel-00628928, version 1 - 4 Oct 2011
JeremerciePierreLEGRANDetAndyTHOMPSONpourm’avoiraccueilliplusieurs
moissurlaligneProxima1etpouravoirpassédenombreusesheuresàm’aiderdans
l’étudestructurale.
Je remercie Simona MIRON pour son aide précieuse et ses conseils avisés en
calorimétrieetendichroïsmecirculaire.
Enfin,jeremercieJosanA.MARQUEZetsonéquipepourlesnombreuxessaisde
cristallisationréaliséssurleurplateformeetpourlaqualitédeleurcollaboration.
Je ne saurai oublier dans ces quelques lignes toutes les personnes du laboratoire,
permanentsetdoctorants,quiontrenducestroisannéesagréables.Millemercisà
tous.
Cela va de soi, je remercie ma famille pour son irremplaçable et inconditionnel
soutien.
Enfin,sijen’avaisqu’unepersonneàremercier,ceseraitcellequipartagemavieet
quialargementcontribuéàl’aboutissementdecetravail.Alorsmillemercis,Caroline,
pourm’avoirsoutenuetsupportédanslesmomentsdifficiles,pourtapatienceettes
nombreusesattentions.
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Nomenclature
Sommaire
NOMENCLATURE 8
INTRODUCTION GENERALE 11
1. REVUE DE LITTERATURE 14
1.1 LES PROTEINES MUTL DANS LA REPARATION DES MESAPPARIEMENTS 14
1.1.1 LAVOIEDEREPARATIONDESMESAPPARIEMENTS 14
1.1.2 MUTLETSESHOMOLOGUES 46
1.2 CONTEXTE DU PROJET: ETUDE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE LA REGION C-
TERMINALE DES HOMOLOGUES EUCARYOTES DE MUTL 55
1.2.1 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEMUTL 55
1.2.2 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEPMS2:ACTIVITEENDONUCLEASE
DUDOMAINEC/TERMINAL 57
1.2.3 ETUDESTRUCTURALEETFONCTIONNELLEDELAFAMILLEMLH1 61
1.3 OBJECTIFS DU PROJET: CARACTERISATION BIOPHYSIQUE ET STRUCTURALE DE LA
REGION C-TERMINALE DE MUTL 63
1.3.1 CARACTERISERLESSITESD'INTERACTIONSDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL 63
ERE1.3.2 RESOLUTIONDELA1 STRUCTUREEUCARYOTEDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL 64
2. MATERIEL ET METHODES 67
2.1 EXPRESSION ET PURIFICATION DES PROTEINES 67
2.1.1 CONSTRUCTIONDESDOMAINES 67
2.1.2 EXPRESSIONETPURIFICATIONDESREGIONSC/TERMINALESDESCMLH1,HSMLH1ET
SCMLH1*SCPMS1 67
2.2 CARACTERISATION BIOPHYSIQUE DES PROTEINES PURIFIEES 72
2.2.1 CARACTERISATIONDUREPLIEMENTPARDICHROÏSMECIRCULAIRE 72
2.2.2 CARACTERISATIONDELAPOLYDISPERSITEPARDIFFUSIONDYNAMIQUEDELALUMIERE 75
2.2.3 CARACTERISATIONDESINTERACTIONSPARCALORIMETRIEATITRAGEISOTHERME 76
2.3 ETUDE DES STRUCTURES TRIDIMENSIONNELLES 79
2.3.1 MODELISATIONPARHOMOLOGIEDUDOMAINEC/TERMINALDUCOMPLEXEMLH1*PMS1 79
2.3.2 MODELISATIONDUPEPTIDEMIPDEEXO1SURLASURFACEDELAREGIONC/TERMINALEDE
MLH1 80
2.3.3 LACRISTALLOGRAPHIEAUXRAYONSXDESPROTEINES 82
3. ANALYSE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DU DOMAINE
C-TERMINAL DE MUTL 97
3.1 IDENTIFICATION ET CARACTERISATION D'UN NOUVEAU SITE D'INTERACTION DE
MLH1 97
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Nomenclature
3.1.1 IDENTIFICATIONDUSITED'INTERACTIONDESPROTEINESCONTENANTUNMOTIFMIPPAR
MUTAGENESEDIRIGEEETMODELISATIONPARHOMOLOGIE 97
3.1.2 PURIFICATIONETCARACTERISATIONBIOPHYSIQUEDELAREGIONC/TERMINALEDEMLH1 103
3.1.3 CARACTERISATIONPARCALORIMETRIEDESINTERACTIONSDEPEPTIDESCONTENANTUN
MOTIFMIPAVECLAREGIONC/TERMINALEDEMLH1 107
3.2 ANALYSE STRUCTURALE DU DOMAINE C-TERMINAL DE MUTL 118
3.2.1 ETUDESTRUCTURALEDUDOMAINEC/TERMINALDEMLH1 118
3.2.2 RESOLUTIONDELASTRUCTURECRISTALLOGRAPHIQUEDELEREGIONC/TERMINALEDU
COMPLEXEMLH1*PMS1DES. CEREVISIAE 124
3.2.3 ANALYSEDELASTRUCTURECRISTALLOGRAPHIQUEDUDOMAINEC/TERMINALDEMUTL DE
S. CEREVISIAE 152
4. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 177
ANNEXE 207
ANNEXE 1: PREPARATION DE BACTERIES CHIMIOCOMPETENTES (INOUE ET AL., 1990) 207
ANNEXE 2: COMPOSITION DU MILIEU DE CULTURE POUR LA PRODUCTION DE PROTEINE
MARQUEE AU SELENIUM 210
ANNEXE 3: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DES DOMAINES 485-769 ET
503-769 DE SCMLH1 211
ANNEXE 4: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DU DOMAINE 486-756 DE
HSMLH1 215
ANNEXE 5: SPECTRE DE DICHROISME CIRCULAIRE ET DENATURATION THERMIQUE DU
VARIANT E682A DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 219
ANNEXE 6: THERMOGRAMME ET ISOTHERME DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 ET DE
PEPTIDES DERIVES DU MOTIF MIP 220
ANNEXE 7: CARACTERISATION PAR BSI DES INTERACTIONS DE PEPTIDES CONTENANT UN
MOTIF MIP AVEC LA REGION C-TERMINALE DE MLH1 224
ANNEXE 8: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1 (485-769) 225
ANNEXE 9: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1 (503-769) 226
ANNEXE 10: PROTOCOLE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DES DOMAINES 485-769 DE
SCMLH1*635-873 DE SCPMS1 228
ANNEXE 11: CONDITIONS DE CRISTALLOGENESE DU CRIBLE DU DOMAINE C-TERMINAL DE
MLH1*PMS1 232
ANNEXE 12: SCRIPTS DE REMPLACEMENT MOLECULAIRE 233
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ANNEXE 13: COMPARAISON DES STUCTURES SECONDAIERS PREDITES ET REELLES DES CTD
DE MLH1 ET PMS1 237
ANNEXE 14: ANALYSE DE L’INTERFACE DE DIMERISATION PAR LE SERVEUR PROTORP ;
RESIDUS DE MLH1 A LA SURFACE DE DIMERISATION 238
ANNEXE 15: ANALYSE DE L’INTERFACE DE DIMERISATION PAR LE SERVEUR PROTORP ;
RESIDUS DE PMS1 A LA SURFACE DE DIMERISATION 239
ANNEXE 16: ALIGNEMENTS DE 10 SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH1 A L’AIDE
DU PROGRAMME KALIGN 240
ANNEXE 17: ALIGNEMENTS DE 10 SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE PMS1 ET 2
SEQUENCES DU DOMAINE C-TERMINAL DE MLH3 A L’AIDE DU PROGRAMME KALIGN 242
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Nomenclature
Nomencl