Investigation of the mechanism of toxicity in newly established models of polyglutamine diseases [Elektronische Ressource] / Niclas Wilhelm Schiffer

Niclas W. Schiffer

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 33
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München






Investigation of the mechanism of toxicity in newly
established models of polyglutamine diseases




Niclas Wilhelm Schiffer
aus
Bad Hersfeld





2008






Erklärung

Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung vom 29.
Januar 1998 von Prof. Dr. Franz-Ulrich Hartl betreut.




Ehrenwörtliche Versicherung

Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.





München, am 30. Januar 2008



Niclas W. Schiffer


Dissertation eingereicht am: 29.05.2008

1. Gutachter: Prof. Dr. Franz-Ulrich Hartl
2. Gutachter: Prof. Dr. Christian Haass

Mündliche Prüfung am: 15.07.2008





Danksagung

Ich möchte mich bei allen bedanken, die mich während meiner Doktorarbeit am Max-Planck-
Institut für Biochemie unterstützt und ermuntert haben.

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. F.-U. Hartl für die interessante Themenstellung und die
Bereitstellung eines Laborplatzes, der der Forschung keine Grenzen setzt. Auch möchte ich
mich für die Teilnahme an den Konferenzen in Berlin, Tomar und Eibsee bedanken, die nicht
nur interessant sondern auch unheimlich motivierend waren. Seine Leidenschaft für die
Wissenschaft ist bewundernswert. Vielen Dank auch an Dr. Manajit Hartl für ihre Ideen und
wertvollen Ratschläge.

Dr. Sarah Broadley danke ich für die freundschaftliche Betreuung, ohne die diese
Doktorarbeit so nicht zustande gekommen wäre. Sie hat immer ein offenes Ohr gehabt und
mir selbstlos nicht nur bei wissenschaftlichen Problemen geholfen.

Prof. Dr. C. Haass danke ich nicht nur für die tolle Kooperation und die Erstellung des
Zweitgutachtens sondern auch für seine großartige Unterstützung. Ebenfalls möchte ich
mich bei Dr. Bettina Schmid für die freundschaftliche und produktive Zusammenarbeit
bedanken. Das Jahr im Fischlabor war unvergesslich, was auch daran lag, dass ich mich nie
als Außenständiger gefühlt habe. Deshalb vielen Dank auch an Frauke, Dominik, Sunita und
vor allem Matthias und Alex, die unermüdlich Fische für mich angesetzt haben.

Auch möchte ich mich bei Dr. Thomas Hirschberger und vor allem Dr. Armin Giese für die
exzellente Zusammenarbeit, Unterstützung und guten Ratschläge bedanken.

Dr. Christian Behrends, Dr. Annette Haacke, Dr. Zoya Ignatova, Dr. Leslie Ripaud, Dr.
Gregor Schaffar sowie Dr. Martin Vabulas danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und
wertvollen Anregungen.

Allen momentanen und ehemaligen Mitarbeitern danke ich für die freundschaftliche und
unterstützende Atmosphäre. Mein spezieller Dank gilt Alex, Annette, Carola, Florian, Manal,
Kausik, Leslie, Markus, Raluca, Sae-Hun, Sathish, Shruti, Sladjana and Steph, die nicht nur
mein Arbeitsalltag sondern auch mein Freizeitleben bereichert haben.

Abschließen möchte ich mit den Menschen, die das alles ermöglicht haben, meinen Eltern
und Großeltern. Danke für die bedingungslose Unterstützung, die aufmunternden Worte,
das Vertrauen und die Zuversicht. Danke für alles. Contents I

1 Summary ..................................................................... 1
2 Introduction ................................................................ 3
2.1 Protein folding..................................................................................................... 3
2.1.1 General aspects of protein folding ..................................................................4
2.1.2 Protein folding in vivo .......................................................................................6
2.2 Protein misfolding and conformational diseases ......................................... 11
2.2.1 Factors that influence the aggregation of proteins......................................12
2.2.2 Amyloidosis......................................................................................................12
2.3 Polyglutamine diseases.................................................................................... 18
2.3.1 Polyglutamine mediated pathogenesis.........................................................18
2.3.2 Huntington’s disease26
2.3.3 SBMA.................................................................................................................29
2.4 Models of polyglutamine disease ................................................................... 34
2.4.1 Yeast ..................................................................................................................35
2.4.2 Zebrafish ...........................................................................................................36
2.5 Aim of thesis ...................................................................................................... 38
3 Materials and Methods............................................ 39
3.1 Material............................................................................................................... 39
3.1.1 Instruments.......................................................................................................39
3.1.2 Chemicals..........................................................................................................40
3.1.3 Buffers and growth media..............................................................................41
3.1.4 Bacterial and yeast strains, cell and zebrafish lines ....................................45
3.1.5 Plasmids and Oligonucleotides .....................................................................46
3.1.6 Antibodies.........................................................................................................48
3.2 Methods.............................................................................................................. 49
3.2.1 DNA subjected methods.................................................................................49
3.2.2 Biochemical ......................................................................................51
3.2.3 Escherichia coli work.........................................................................................55
3.2.4 Yeast work ........................................................................................................56
3.2.5 Cell culture work .............................................................................................60
3.2.6 Zebrafish work.................................................................................................62
4 Results........................................................................ 66
4.1 Development of a zebrafish model for polyglutamine disease suitable for
whole organism validation of candidate compounds ........................................... 67
4.1.1 The establishment and characterization of a zebrafish model of HD.......67
4.1.2 Identification of compounds that inhibit polyglutamine aggregation.....77
4.2 N-terminal polyglutamine-containing fragments inhibit androgen
receptor transactivation function in a yeast model of SBMA ............................... 83 Contents II

4.2.1 Development and characterization of a yeast model for SBMA ...............84
4.2.2 A newly established reporter system to evaluate the effect of the
polyglutamine stretch on AR transactivation capacity.............................................94
4.2.3 Analysis of the effect of N-terminal polyglutamine-containing AR
fragments on AR transactivation capacity..................................................................97
4.2.4 Analysis of the effect of polyglutamine-expanded huntingtin exon 1 on
AR transactivation capacity........................................................................................104
5 Discussion ............................................................... 110
5.1 Danio rerio, a new model organism to identify inhibitors of polyglutamine
aggregation ................................................................................................................ 112
5.1.1 Zebrafish model for HD................................................................................112
5.1.2 The anti-prion compounds inhibit the aggregation of poly-
glutamine-expanded fragments.................................................................................115
5.2 Saccharomyces cerevisiae, a model organism to study mechanisms of
polyglutamine mediated toxicity............................................................................ 119
5.2.1 A yeast model for SBMA ..............................................................................119
5.2.2 N-terminal polyglutamine-expanded AR fragments decrease AR
transactivation capacity...............................................................