Lateral organization of the transmembrane domain and cytoplasmic tail of influenza virus hemagglutinin revealed by time resolved imaging [Elektronische Ressource] / von Silvia Scolari

Silvia Scolari

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• Publié le: 01 janvier 2009
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• Langue: Deutsch
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Extrait

Lateral organization of the transmembrane domain
and cytoplasmic tail of influenza virus
hemagglutinin revealed by time resolved imaging
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
in Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dottore in Biotecnologie
Silvia Scolari
geb. 12.05.1981 in Padova, Italien
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter: 1. Prof. Andreas Herrmann
2. PD Michael Veit
3. Prof. Manuel Prieto



Tag der mündlichen Prüfung: 24.07.09Alla mia famiglia
Zusammenfassung
Die Freisetzung vieler Hüllviren findet an der Plasmamembran (PM) statt. Der
Viruspartikelzusammenbau hängt von der Anreicherung viraler Untereinheiten in spezifischen
Domänen der PM ab. Es wird vorgeschlagen, dass Membran-Rafts – geordnete, Sphingomyelin- und
Cholesterin-reiche Mikrodomänen in der PM – als lokale Rekrutierungsstellen dienen.
Hämagglutinin (HA) ist ein homotrimeres Glykoprotein in der Hülle des Influenzavirus. Es
vermittelt die Bindung an die Wirtszelle und die Fusion mit der endosomalen Membran. Es wird
angenommen, dass HA eine wichtige Rolle bei der Abschnürung neuer Viruspartikel von der Zelle
spielt. Zwei Hauptbeobachtungen führten zu der Hypothese, dass sich HA in Lipid-Mikrodomänen
einlagert: HA wurde biochemisch in Detergens-resistenten Membranen nachgewiesen und die
Virushülle ist mit Lipiden angereichert, die Rafts bilden. Um die Rolle der HA-
Transmembrandomäne für die Lipid-Raft-Inkorporation aufzuklären, wurde ein Konstrukt
entwickelt, das den C-Terminus von HA, mit dem gelb fluoreszierenden Protein YFP fusioniert, und
die Transmembrandomäne, nicht aber die N-terminale Ektodomäne von HA enthält. In transfizierten
Säugetierzellen wurde der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischen diesem Konstrukt
und einem GPI-verankerten cyan fluoreszierenden Protein CFP (Raft-Marker) durch Fluoreszenz-
Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich HA-Konstrukte in
Cholesterin-abhängigen Lipiddomänen anreichern, was durch eine erhöhte FRET-Effizienz
nachgewiesen wurde. Zudem führen der Entzug von Cholesterin aus der PM und die Deletion der
drei hochkonservierten Palmitylierungsstellen von HA zu einer signifikanten Verringerung der
FRET-Effizienz. Schließlich wurde ein sehr stark verringerter Energietransfer zwischen dem HA-
Konstrukt und einem Marker für Nicht-Raft-Bereiche gemessen. Darüber hinaus konnte mit Hilfe
von ortsspezifischer Mutagenese gezeigt werden, dass die verwendeten HA-Konstrukte
Disulfidbrücken-verbundene Oligomere bilden und dass dies eine Voraussetzung für den Transport
der Konstrukte an die PM ist. Zeitaufgelöste Anisotropiemessungen ergaben für diese ein starkes
Homo-FRET-Signal, welches für eine lokale Anhäufung spricht und somit die
Oligomerisierungshypothese bestätigt.

Schlagwörter: Influenzavirus, Hämagglutinin, FLIM-FRET, Lipid Rafts, Zusammenbau.
Abstract
Numerous enveloped viruses bud from the host cell plasma membrane (PM). The assembly of the
new viral particles depends on the accumulation of the viral subunits at specific sites of the cell
membrane. Lipid domains or “rafts” enriched of sphingomyelin and cholesterol have been suggested
as sites for local recruitment of viral components. Hemagglutinin (HA) is a homotrimeric
glycoprotein embedded in the envelope of influenza virus. It mediates binding of the virus to the
host cell as well as fusion between the viral envelope and the endosomal membrane. HA might play
an important role in budding of the new viral particles from the host cell. Two main observations led
to the suggestion that HA entraps in lipid microdomains. First, HA was rescued in DRM fractions,
second the viral envelope was found to be enriched in lipids generally forming rafts.
To elucidate the role of the HA transmembrane domain in lipid raft localization we expressed
constructs harboring the transmembrane domain and the cytoplasmic tail but lacking the N-terminal
ectodomain of HA in the PM of mammalian cells (CHO-K1). We studied energy transfer (FRET)
between these constructs and a GPI anchored CFP as a raft marker by fluorescence lifetime imaging
microscopy (FLIM). Our results suggest that HA constructs are indeed sorted and enriched into
cholesterol-dependent lipid domains indicated by enhanced FRET efficiency. This is supported by
the observation that cholesterol depletion of the PM caused a significant decrease of FRET.
Likewise, deletion of the three highly conserved palmitoylation sites of HA is also accompanied by a
reduction of FRET efficiency. Finally, very low energy transfer was measured upon coexpression of
the HA construct with a non-raft marker protein.
In addition, site directed mutagenesis demonstrated that TMD-HA constructs form disulfide linked
oligomers and that oligomerization is a prerequisite for the transport to the plasma membrane. This
result was corroborated by time resolved anisotropy measurements that revealed strong homoFRET
between TMD-HA-YFP molecules, thus indicating protein clustering. Oligomerization of TMD-HA
contructs is in agreement with the observation that the trimerization of full length HA is fundamental
for the stability of the glycoprotein and the subsequent delivery of the protein to the cell surface.

Key Words: influenza virus, hemagglutinin, FLIM-FRET, lipid rafts, assembly.

Abbreviations
A Alanin HIV Human immunodeficiency virus
C, Cys Cystein IRF Instrument response function
Cyan fluorescent protein,
CFP, mCFP K Lysin monomeric cyan fluorescent
protein
CHO-K1 Chinese hamster ovary lo Liquid ordered
CT Cytoplasmic tail ld Liquid disordered
Cyt D Cytochalasin D K Lysin
DAF Decay accelerationg factor LPH Lactase phlorizin hydrolase
DRM Detergent resistant membranes mCer Monomeric cerulean
DTT Dithiothreitol MDCK-II Madin-Darby canine kidney
E FRET efficiency Myr Myristoylation
EndoH Endoglycosidase H MβCD Methyl-β-Cylodextrin
ER Endoplasmic reticulum NNT Glycosylation site

Fluorescence lifetime imaging FLIM Pal Palmitoylation
microscopy

Fluorescence photoactivation FPALM Rw Reverse primer localization microscopy

Förster resonance energy FRET S Serin
transfer
Fw Forward primer SEM Standard error of the mean
GPI Glycosylphosphatidylinositol SFV Semliki forest virus
GPMV Giant plasma membrane vesicle SD Standard deviation
Time correlated single photon
HA Hemagglutinin TCSPC counting
HA Hemagglutinin precursor TMD Transmembrane domain 0
Yellow fluorescent protein,
HA , HA Hemagglutinin subunits YFP, mYFP 1 2 monomeric yellow fluorescent
protein


Index
ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................III
ABSTRACT............................................................................................IV
ABBREVIATIONS................................................................................... V
1 INTRODUCTION .............................................................................. 1
1.1 Influenza Virus........................................................................................1
1.1.1 Influenza Virus replication .....................................................................3
1.1.2 The glycoprotein Neuraminidase.............................................................4
1.1.3 The glycoprotein Hemagglutinin .............................................................4
1.1.3.1 Folding, trimerization and transport of Hemagglutinin.........................7
1.1.3.2 The Hemagglutinin anchor...............................................................7
1.1.3.3 Hemagglutinin functions..................................................................8
1.1.3.4 Assembly and budding of influenza virus......................................... 10
1.2 GPI Membrane anchors .........................................................................12
1.3 Lipid microdomains ...............................................................................13
1.3.1 Methods for detecting membrane microdomains..................................... 16
1.4 Time resolved fluorescence spectroscopy..............................................17
1.4.1 Förster resonance energy transfer (FRET).............................................. 18
1.4.2 Fluorescence Lifetime Imaging FRET Microscopy (FLIM-FRET) .................. 20
1.4.3 Steady-State Anisotropy ..................................................................... 20
1.4.4 Time resolved anisotropy decays.......................................................... 23
2 AIM OF THE THESIS ...................................................................... 25
3 MATERIALS AND METHODS ........................................................... 27
3.